Specific Antigen In Vivo Ensaio Killing usando células CFSE rotuladas Alvo
Summary
Muitas infecções provocar uma forte resposta CTL, mas, ocasionalmente, a quantidade de células que respondem não se relaciona com o controle do patógeno<sup> 1</sup>. Uma medida da qualidade do CTL é a sua capacidade de matar especificamente<sup> 2</sup>. Rotulagem CFSE de células-alvo pode ser usado para investigar esta qualidade de resposta CTL<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.
Abstract
Diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) pode ser usado para facilmente e rapidamente rótulo uma população de células de interesse para a investigação in vivo. Esta rotulagem tem sido classicamente utilizado para o estudo da proliferação e migração. No método aqui apresentado, temos reduzido o cronograma, após a transferência adotiva de olhar para a sobrevivência e morte de epítopo específico CFSE células-alvo marcado 4-6. O nível de matar específica de um clone de células T CD8 + pode indicar a qualidade da resposta, como a sua quantidade pode ser enganosa. Específicos células T CD8 + podem se tornar funcionalmente esgotado ao longo do tempo com um declínio na produção de citocinas e matando 7,8. Além disso, certos CD8 + clones de células T não pode matar, bem como outros com diferentes especificidades TCR 9. Eficazes para Imunidade mediada por células (CMI), os antígenos devem ser identificados que produzem não apenas um número adequado de células T responder, mas também funcionalmente robusta células T responder. Aqui nós avaliamos a morte de células específicas de dois por cento peptídeo clones específicos de células T em camundongos BALB / c.
Protocol
Discussion
Este ensaio pode ser modificado para investigar a capacidade proliferativa das células, incluindo a expansão clonal, porque CFSE relativamente divide igualmente entre os descendentes 10,11. Também é possível usar rotulagem CFSE para investigar a migração celular 6,12, embora existam outras células rastreamento métodos que podem ser mais apropriadas dependendo da hipótese, por exemplo tetrâmeros e bioluminescência 13, que também pode ser combinado com rotulagem CFSE.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaria de agradecer a Bianca Mothé, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio por me apresentar ensaios imunológicos e manuseio do mouse. Trabalho no laboratório de GA Splitter é financiado pelo NIH conceder 1-RO1-AI-073558, GLRCE conceder 1-U54-AI-057153, e BARD EUA-3829-06.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 96-well plate | Costar | 3799 | ||
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | ||
| DMSO | Sigma | D-5879 | ||
| FBS | GIBCO | 16000-077 | ||
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | n/a | ||
| Kontes glass tissue grinder | Kontes | 885300-0015 | ||
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | ||
| Needle | B-D | 305175 | ||
| Parafilm “M” | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | ||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | ||
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | ||
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-093 | ||
| Syringe | B-D | 309602 | ||
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen (Molecular Probes) | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .
