Summary

Specific Antigen In Vivo Ensaio Killing usando células CFSE rotuladas Alvo

Published: November 09, 2010
doi:

Summary

Muitas infecções provocar uma forte resposta CTL, mas, ocasionalmente, a quantidade de células que respondem não se relaciona com o controle do patógeno<sup> 1</sup>. Uma medida da qualidade do CTL é a sua capacidade de matar especificamente<sup> 2</sup>. Rotulagem CFSE de células-alvo pode ser usado para investigar esta qualidade de resposta CTL<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.

Abstract

Diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) pode ser usado para facilmente e rapidamente rótulo uma população de células de interesse para a investigação in vivo. Esta rotulagem tem sido classicamente utilizado para o estudo da proliferação e migração. No método aqui apresentado, temos reduzido o cronograma, após a transferência adotiva de olhar para a sobrevivência e morte de epítopo específico CFSE células-alvo marcado 4-6. O nível de matar específica de um clone de células T CD8 + pode indicar a qualidade da resposta, como a sua quantidade pode ser enganosa. Específicos células T CD8 + podem se tornar funcionalmente esgotado ao longo do tempo com um declínio na produção de citocinas e matando 7,8. Além disso, certos CD8 + clones de células T não pode matar, bem como outros com diferentes especificidades TCR 9. Eficazes para Imunidade mediada por células (CMI), os antígenos devem ser identificados que produzem não apenas um número adequado de células T responder, mas também funcionalmente robusta células T responder. Aqui nós avaliamos a morte de células específicas de dois por cento peptídeo clones específicos de células T em camundongos BALB / c.

Protocol

1. Provocando destino-específico CTLs efetoras de Imunização (Dia 0) Antes de começar, decida em cima de um efetor específicos: sistema de destino. Neste exemplo de um clássico ensaio in vivo de CTL, usaremos uma imunização peptídeo purificado para provocar específicas CD8 + T células. O peptídeo mesma será usada para pulso as células-alvo singênico, criando um efetor específicos: sistema de destino. Alternativamente, você pode optar por utilizar patógeno todo ou proteínas para obt…

Discussion

Este ensaio pode ser modificado para investigar a capacidade proliferativa das células, incluindo a expansão clonal, porque CFSE relativamente divide igualmente entre os descendentes 10,11. Também é possível usar rotulagem CFSE para investigar a migração celular 6,12, embora existam outras células rastreamento métodos que podem ser mais apropriadas dependendo da hipótese, por exemplo tetrâmeros e bioluminescência 13, que também pode ser combinado com rotulagem CFSE.

<p c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaria de agradecer a Bianca Mothé, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio por me apresentar ensaios imunológicos e manuseio do mouse. Trabalho no laboratório de GA Splitter é financiado pelo NIH conceder 1-RO1-AI-073558, GLRCE conceder 1-U54-AI-057153, e BARD EUA-3829-06.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 mm glass beads   Biospec Products 11079110  
70 μm cell strainer   BD Falcon 352350  
96-well plate   Costar 3799  
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant   Pacific Immunology n/a  
DMSO   Sigma D-5879  
FBS   GIBCO 16000-077  
FC 500 Flow Cytometer   Beckman Coulter n/a  
Kontes glass tissue grinder   Kontes 885300-0015  
Mini Beadbeater   Biospec Products n/a  
Needle   B-D 305175  
Parafilm “M”   Pechiney Plastic Packaging PM992  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 157-8  
PBS   GIBCO 10010-023  
PharmLyse lysing reagent   BD Biosciences 555899  
RPMI 1640   GIBCO 11875-093  
Syringe   B-D 309602  
Vybrant CFSE Kit   Invitrogen (Molecular Probes) V12883  

References

  1. Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
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Cite This Article
Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

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