אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד
Summary
זיהומים רבים לתגובה CTL חזק, אבל מדי פעם, כמות התאים להגיב אינו תואם לשליטה של הפתוגן<sup> 1</sup>. אחד המדדים לבחינת איכות CTL הוא היכולת שלהם להרוג במיוחד<sup> 2</sup>. תיוג CFSE של תאים היעד יכול לשמש כדי לחקור את איכות התגובה CTL<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.
Abstract
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFSE) יכול לשמש בקלות ובמהירות תווית האוכלוסייה תא עניין של בחקירה vivo. תיוג זה קלאסי שימשו במחקר התפשטות והגירה. בשיטה המוצגת כאן, יש לנו לקצר את ציר הזמן לאחר העברת המאמצת להסתכל הישרדות הרג epitope ספציפי שכותרתו CFSE תאים היעד 4-6. רמת הרג ספציפי של שיבוט CD8 + T תא יכולה להעיד על איכות התגובה, כמו הכמות שלהם עלולה להטעות. ספציפיות CD8 + T תאים יכול להיות מותש מבחינה תפקודית לאורך זמן עם ירידה ייצור ציטוקינים והרג 7,8. כמו כן, בטוח CD8 + T שיבוטים תא לא יכול להרוג, כמו גם עם אחרים שונים ספציפיות TCR 9. לקבלת חסינות מתווכת יעיל תא (CMI), אנטיגנים חייב להיות מזוהה המייצרים לא רק מספרים נאותה להגיב בתאי T, אלא גם חזקים מבחינה פונקציונלית ותאי T להגיב. כאן אנו בוחנים את התא אחוז הרג ספציפי של שני פפטיד ספציפי שיבוטים תא T ב BALB / c עכברים.
Protocol
Discussion
Assay זה יכול להיות שונה כדי לחקור את יכולת שגשוג של תאים, כולל הרחבת המשובטים, כי CFSE מתחלק יחסית שווה בשווה בין הצאצאים 10,11. אפשר גם להשתמש תיוג CFSE לחקור נדידת תאים 6,12, אם כי ישנם תאים אחרים התחקות השיטות עשוי להיות מתאים יותר בהתאם להשערה שלך, tetramers דוגמה פליט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אני רוצה להודות ביאנקה Mothé, קרלה Oseroff, ומארי צרפת DelGuercio מציגה לי מבחני החיסוני וטיפול העכבר. העבודה במעבדה של ספליטר GA ממומנת על ידי מענק 1-NIH RO1-AI-073558, GLRCE מענק 1-U54-AI-057153, ובארד ארה"ב 3829-06.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 96-well plate | Costar | 3799 | ||
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | ||
| DMSO | Sigma | D-5879 | ||
| FBS | GIBCO | 16000-077 | ||
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | n/a | ||
| Kontes glass tissue grinder | Kontes | 885300-0015 | ||
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | ||
| Needle | B-D | 305175 | ||
| Parafilm “M” | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | ||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | ||
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | ||
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-093 | ||
| Syringe | B-D | 309602 | ||
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen (Molecular Probes) | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .
