Hemos desarrollado un vector lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, el elemento de respuesta Rev (RRE) que pueden regular la expresión del gen de una forma del VIH-1 Tat y Rev-dependiente. El vector permite la detección específica de la replicación del VIH en las células vivas a través de la expresión de GFP.
La mayoría de los vectores de la expresión del VIH-respuesta se basan en el promotor del VIH, la repetición terminal larga (LTR). Mientras que responda a una de las primeras proteínas del VIH, Tat, el LTR es también sensible a los estados de activación celular y la actividad de la cromatina local, donde la integración se ha producido. Esto puede resultar en altas tasas de VIH-independiente de la actividad, y ha limitado la utilidad de la LTR basado en reportero para marcar las células con VIH 1,2,3. Aquí se construyó un vector de expresión lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, numerosas secuencias de ADN del VIH que incluyen el elemento Ap-respuesta y los sitios de empalme VIH 4,5,6. El vector se incorporó a un reportero lentiviral virus, lo que permite una detección muy específica de la replicación del VIH en las poblaciones de células vivas. La actividad del vector se mide por la expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP). La aplicación de este vector como se informó aquí ofrece un enfoque alternativo nuevo a los métodos existentes, como la PCR in situ o tinción del antígeno, para identificar el VIH de células positivas. El vector también puede expresar genes terapéuticos para la experimentación básica o clínica para orientar el VIH de células positivas.
Al igual que con los vectores de expresión antes desarrollado Tat-dependientes, el sistema de Apocalipsis se describe aquí es una explotación de un proceso de evolución del VIH. La inclusión de Rev-dependencia hace que el vector de expresión basado en LTR depende en gran medida la presencia de la replicación del VIH. La aplicación de este vector como se informó aquí, un reportero de virus VIH-dependiente, ofrece un nuevo enfoque nuevo para identificar el VIH de células positivas. El vector permite el examen de las células vivas, se puede expresar cualquier gen para la experimentación básica y clínica, y como un lentivirus pseudo-tipo tiene acceso a más tipos de células y tejidos.
The authors have nothing to disclose.
El trabajo fue apoyado en parte por el Servicio de Salud Pública 1R01AI081568 subvención del NIAID para YW y por las generosas donaciones de los donantes y los jinetes de la Cabalgata 2009 NYCDC SIDA organizada por M. Rosen y Day2 Inc.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Biosafety Cabinet | ||||
37°C 5%CO2 incubator | ||||
Flow cytometer | FACSCalibur | |||
Centrifuge | Beckman | Allega™6KR | ||
4°C regrigerator | ||||
-20°C refrigerator | ||||
-80°C refrigerator | ||||
Cell counter | Nexcelom | Cellometer™ AutoT4 | ||
HEK293T cell line | NIH | |||
CEM-SS cell line | NIH | |||
Jurkat cell line J1.1 | NIH | |||
DMEM | Invitrogen | 11965-118 | ||
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | ||
HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | ||
HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | |||
pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | |||
pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | |||
pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | |||
pHCMV-G | ||||
10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | ||
2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | ||
1% paraformaldehy | Sigma Aldrich | 158127 | ||
Bleach | ||||
50ml Falcon tubes | BD Bioscience | 358206 | ||
5ml round bottom tubes | BD Bioscience | 352063 | ||
0.45μM Millipore filter | Millipore | SLHA033SS | ||
0.20μM Millipore filter | Millipore | SLFG85000 | ||
100mm Petri-dish | Sigma Aldrich | CLS430588 | ||
Size-exclusion column (100,000MW cut off) | SartoriuStedim biotech | VS2041 | ||
2ml frozen tube | Axygen | SCT-200 | ||
96-well plate | BD Bioscience | 353227 | ||
1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT- 175-C |