تمييز خلايا محددة HIV - 1 الإيجابية باستخدام المتجهات التي تعتمد على رؤيا Lentiviral وإذ تعرب عن البروتين الأخضر نيون

1. ترنسفكأيشن من البلازميدات لإنتاج الجسيمات التي تعتمد على رؤيا Lentiviral إعداد : ووصف القس تعتمد على ناقلات lentiviral GFP ، PNL – GFP – RRE – SA ، 4،5،6 سابقا. لتجميع الجسيمات إلى الفيروسية ، وكان contransfected البلازميد في HEK293 الخلايا التائية مع HIV – 1 بناء التعبئة والتغليف ، pCMVΔ8.2 (شريطة تتكرم الدكتور Dider Trono) ، وبلازميد يحمل بروتين سكري VSV – G (pHCMV – G) . تم تنفيذ ترنسفكأيشن خارج باستخدام الأسلوب فوسفات الكالسيوم. إعداد المخازن : 10 X HBS (Hepes التخزين المؤقت مالحة) أعد بحل 5 غرام من Hepes و 8 غم من كلوريد الصوديوم ، 0،37 غرام من بوكل ، 1 غرام من سكر العنب ، 0.103 غرام من الصوديوم هبو 2 4 (اللامائية) في 100 مليلتر من H 2 O. قسامة the10 العازلة HBS X في aliquots مل (1) ومخزن في -20 درجة مئوية. في وقت ترنسفكأيشن ، تحويل 10 X إلى HBS HBS X 2 مع H 2 O (1 : 5 تمييع) ، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى ما بين 7،05-7،12. (لمدة 10 مل HBS X 2 ، فإنه يتطلب عادة حوالي 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1M). فلتر تعقيم العازلة HBS 2X التي تمر عبر مرشح 0.22 ميكرومتر ميليبور. وأدلى CaCl 2 العازلة حل CaCl 2 في Hepes 10 مم إلى تركيز 2M النهائي. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.8 ، تصفية وتعقيم العازلة المحل في 4 درجات مئوية. الإجراء : قبل يوم واحد لترنسفكأيشن والبذور 2 × 10 6 خلايا HEK293T في 100 مم طبق بيتري ، وتنمو الخلايا خلال الليل في 10 مل DMEM FBS 10 ٪ + 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. في اليوم التالي ، وإزالة الخلايا من طاف واستبدالها مع 5 مل الطازجة DMEM FBS + 10 ٪ ، وخلايا الثقافة بشكل مستمر لمدة 4 ساعات. في أنبوب البوليسترين 5 مل ، أضف 480 ميكرولتر العازلة HBS 2X. في الثانية 5 مل أنبوب البوليسترين ، إضافة 60 ميكرولتر 2M CaCl 2 العازلة ، بلازميد الحمض النووي ، وترنسفكأيشن TE العازلة (1 ملم تريس ، EDTA 25 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0) إلى وحدة تخزين ما مجموعه 480 ميكرولتر. لكل صحن بيتري ، ينبغي إضافة البلازميدات في نسبة 10 ميكروغرام من PNL – GFP – RRE – SA ، و 7.5 ميكروغرام من pCMVΔR8.3 ، و 2.5 ملغ من pHCMV – G. إضافة البلازميد الحمض النووي CaCl 2 نقطه نقطه الخليط في أنبوب HBS 2 X ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وسوف يعجل غرامة النموذج. إضافة ميكرولتر 960 من الخليط نقطه نقطه بواسطة ماصة للخلايا. احتضان ثاني أكسيد الكربون في 37 ° C ، 5 2 ٪ بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، إزالة طاف وإضافة 10 مل الطازجة DMEM FBS + 10 ٪ ، واحتضان خلايا باستمرار في 37 ° C CO ، 5 2 ٪ بين عشية وضحاها. في 48 ترنسفكأيشن آخر ساعة ، الحصاد الفيروس عن طريق ازالة طاف ونقله في أنابيب معقمة 50 مل. إضافة 10 مل الطازج الطازجة DMEM FBS + 10 ٪ في كل طبق بيتري ، والاستمرار في الثقافة بين عشية وضحاها. تخزين طاف الفيروس في 4 درجات مئوية. تواصل الحصاد في آخر 72 ساعة ترنسفكأيشن عن طريق جمع طاف. الجمع بين جميع supernatants ، وأجهزة الطرد المركزي في supernatants في 500 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير وإزالة الحطام الخلية. تم جمع طاف وتصفيتها من خلال تصفية 0.22 ميكرومتر ميليبور. وتركز كذلك على الفيروس من خلال الحجم استبعاد الأعمدة. 2. تركيز الجسيمات الفيروسية وتحديد العيار الحجمي الفيروسية وتركزت الجسيمات الفيروسية حسب عمود الحجم الاستبعاد (100،000 ميغاواط قطع ، Centricoin). تم تحميل طاف الفيروسي في العمود ، وطرد في 6000 XG عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وقد تم جمع طاف الفيروسية المركزة ، aliquoted ، وتخزينها في -80 درجة مئوية. تم تحديد عيار عن طريق العدوى الفيروسية من TNF المعاملة ، HIV – 1 إيجابية سترات خط الخلية ، J1.1 7. والخلايا المستزرعة في صفيحة جيدا في 96 2.5 × 5 10 خلايا لكل مل (100 مل حجم الإجمالي) ، واصاب مع 100 مل من المخفف متسلسل VNL – GFP – RRE – SA لمدة أسبوع. قدرت عيار (TCID50) من الجسيمات عن طريق العد الآبار GFP الإيجابية التالية طريقة ريد ومونش 8. 3. بمناسبة HIV – 1 خلايا ايجابي مع الجسيمات Lentiviral ، VNL – GFP – RRE – SA إعداد : لأول مرة كانت مصابة CD4 T خط الخلية البشرية ، CEM – SS ، مع HIV – 1. إصابة آخر في 48 ساعة ، وكانت superinfected الخلايا التي تحتوي على جزيئات lentiviral ، VNL – GFP – RRE – SA. عدوى التالية ليومين آخرين ، وجرى تحليل GFP إيجابية الخلايا التدفق الخلوي. كعنصر تحكم ، HIV – 1 أصيبوا مماثل المعافين CEM – SS – VNL الخلايا مع GFP – RRE – SA. أعطى فقط HIV – 1 – المصابة CEM – SS ارتفاع الخلايا إلى خلايا GFP ايجابية لكنها ليست مصابة HIV – 1 – SS CEM الخلايا. الإجراء : قبل ساعتين من الإصابة ، إضافة إلى تركيز polybrane النهائي 4 ملغ / مل. عدد الخلايا واتخاذ 2 × 10 5 خلايا لكل العدوى. تصيب الخلايا التي تحتوي على 200 نانوغرام (P24) من HIV – 1 – 3 NL4 لمدة 2 ساعة. غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقائق ، resuspendالخلايا في الخلايا 2 × 5 10 / مل ، والثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. عدد الخلايا واتخاذ 2 × 10 5 خلية لكل عدوى VNL – GFP – RRE – SA. إضافة 100 مل من VNL – GFP – RRE – SA واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. غسل الخلايا وresuspend في 2 × 5 10 خلايا / مل. إجراء تحليل تدفق الخلوي في 48 عدوى آخر ساعة. وكانت الخلايا المصابة مكعبات ومعلق في paraformaldehede 500 مل 1 ٪ ، حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، وتحليلها ثم محلل FACScan (بيكتون ديكنسون). 4. ممثل النتائج إذا تم تنفيذ هذه التجارب بنجاح ، سيتم الكشف عن مجموعة من السكان GFP كبيرة في الخلايا CEM – SS – 1 – فيروس نقص المناعة البشرية المصابة من تدفق عداد الكريات ، في حين ، في السيطرة ، لن تكون الخلايا GFP ايجابية في الكشف عن HIV – 1 المعافين SS – CEM الخلايا. إذا كان يتم تنفيذها بنجاح التجارب ، والتي تعتمد على ناقلات رؤيا lentiviral ، VNL – GFP – RRE – SA ، سوف تسمح للكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية محددة للغاية من السكان المقيمين في تكرار الخلية ، من خلال قياس مخضر التعبير (GFP) البروتين. في هذا المثال ، تم صبغ تحصد CEM – SS خلايا الفئران مع الأضداد وحيدة النسيلة PE المسمى ضد الماوس CD24 ، HSA ، وتحليلها ثم على تدفق عداد الكريات لكلا هائل سعيد أنعم والتعبير GFP. الشكل 1. وكما هو موضح هنا ، تم الكشف عن مجموعة من السكان GFP كبير في HIV – 1 – الخلايا المصابة superinfected مع VNL – GFP – RRE – SA (الشكل 1C). في المقابل ، لم يتم اكتشاف خلايا GFP إيجابية في الخلايا إما CEM – SS HIV – 1 غير مصاب دون عدوى lentiviral (الشكل 1A) أو HIV – 1. الخلايا غير المصابة مع عدوى lentiviral (1B الشكل)