Bioassays zur Überwachung Insecticide Resistance

1. Einführung Die Nahrungsmittelproduktion ist von größter Bedeutung bei der Realisierung werden, dass bis zum Jahr 2025 wird die Welt eine Bevölkerung von 8,04 Milliarden Menschen 1 zu erreichen. Es wird die Notwendigkeit, eine größere Menge von Nahrungsmitteln, als derzeit produziert liefern. Ausreichende Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln wird nicht in der Lage sein, ohne den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln wie Pestizide, um die Menge der Ernteerträge zu steigern und Aufrechterhaltung der Qualität. Basierend auf den historischen und aktuellen Abhängigkeit von Pestiziden, wird Instanzen von Pestizid-Resistenz weiterhin auftreten und in der wissenschaftlichen Literatur berichtet werden. Pest Resistenz gegen Pestizide ist problematisch, weil die Produkte ein integraler Bestandteil der ertragreichen und qualitativ hochwertige Produktion der Landwirtschaft sind. Allerdings kann Überbeanspruchung und / oder Missbrauch eines Pestizids auf die Entwicklung von Resistenzen, die sich nachteilig auf die pflanzliche Erzeugung führen kann. Schädlinge (zB Insekten, Unkräuter, Krankheitserreger, etc.) entwickeln eine Resistenz durch eine Vielzahl von Mechanismen, sondern eine wichtige Triebkraft für die Entwicklung von Resistenzen ist der Mangel an registrierte Pestizide 1 mit unabhängigen Wirkmechanismen zur Verfügung. Wenn nur wenige Produkte für eine individuelle Schädlingsbekämpfung sind innerhalb einer bestimmten Kultur-System bezeichnet, sind chemische Steuerungsmöglichkeiten begrenzt. Daher ist die gleiche Chemikalie (n) immer wieder und verwendet kontinuierlichen Selektionsdruck auf den Schädling gelegt. Dieses Problem wird verschärft, wenn der Schädling über mehrere Generationen in einem einzigen Jahr, und jede Generation ist es, das Pestizid ausgesetzt. Es gibt sowohl finanzielle als auch enrivornmental Kosten, die mit Resistenz 2 zugeordnet. Pest Widerstand führt zu höheren und häufigeren Anwendungen von Pestiziden erforderlich, um eine zufrieden stellende Kontrolle zu erreichen. Ertragsverluste sind wahrscheinlich auch auftreten, nachdem zunehmende Einsatz von Pestiziden aufgrund der Nichterfüllung des Ziels Schädlingsbekämpfung. Pimentel 2 schätzt diese Kosten von Pestizid-Resistenz in den Vereinigten Staaten auf rund $ 1500000000 jährlich. Umfragen von Pestizid-Anfälligkeit unter Schädlingspopulationen ist ein proaktiver Ansatz zu einer Verschiebung Insektizid Leistung erkennen und bieten ein Frühwarnsystem zur chemischen Bekämpfung Strategien zu ändern. Durch die Veränderung insgesamt IPM-Strategien kann die Lebensfähigkeit der ein bestimmtes Pestizid verlängert werden, was wiederum wichtig ist für die Landwirtschaft weiterhin genug zu essen und Faser für die Welt zu bieten. Dieses Papier beschreibt ein Protokoll, das verwendet werden, um Insektizid Anfälligkeit überwachen und erkennen die Entwicklung von Insektiziden resistenten Populationen mit den Erwachsenen Fläschchen Test 3 für den Kontakt Insektizide und eine Modifikation dieser Test für den Anlagenbau systemische Insektizide 4 können. 2. Methoden 2.1 Sicherheits-und Verlustrechnung Mit den geeigneten Sicherheitsvorkehrungen ist wichtig beim Umgang mit Insektiziden. Wenden Sie sich an den Material Safety Data Sheet (MSDS) für geeignete Persönliche Schutzausrüstung (PSA) vor dem Umgang mit Pestiziden. Spezielle Labor Ausbildung für den Umgang mit Pestiziden in Laboratorien sollten durch das Personal, bevor Sie eine Bioassays erforderlich sein. 2,2 machen Stammlösung Entwickeln Sie eine Stammlösung von einer bekannten Konzentration von einer Quelle von Insektizid Wirkstoff (AI). Alle gewünschten Konzentrationen enthalten als Behandlungen im Tierversuch von der Original-Stammlösung hergestellt werden. Für das Interesse dieser Arbeit, 100mls von 100 pg / ml-Lösung wird als Stammlösung entwickelt werden, jedoch kann jeder Konzentration aus dieser anfänglichen Konzentration verdünnt werden. Passen Sie die Menge an technischem AI auf der Basis der Prozent Reinheit abgewogen werden. Belaufen sich auf abgewogen werden = (Volumen zu machen) X ([# g / ml-Lösung] / [% purity/100]) Zum Beispiel würde es erfordern 10152.284 ug technischen AI zu 100 ml einer 100 ug / ml Lösung eines technischen Insektizid von 98,5% Reinheit zu machen: (100 ml) X ([100μg/ml] / 0,985) = 10.152,284 pg 2.2.1 Adult Vial Test für Contact Insektizide Teilweise füllen einen Messkolben mit Aceton und wiegen die eingestellte Menge an Insektizid AI. Spülen Sie das Gewicht Boot mit Aceton in den Kolben, um alle Insektizid aus der wiegen Boot zu entfernen. Füllen Sie den Messkolben bis zur Teilung mit Aceton. Die meisten Lösungen in gekühlten Bedingungen stattfindet Aktivität ohne nennenswerten Verlust der Wirksamkeit für etwa einen Monat zu halten. 2.2.2 Änderung der Adult Vial-Test für systemische Insektizide Intoxication von Insekten mit systemischen Insektiziden unterscheidet sich deutlich von dem der Kontakt Produkte. Systemische Produkte müssen in der Regel von den Insekten aufgenommen werden, sich statt der Insekten aktiv having direkten Kontakt mit dem Produkt als mit Kontakt-Insektiziden. Daher wurde die erwachsenen Fläschchen zu testen, um für die systemische Insektizide getestet werden modifiziert. Das Gewicht der KI für die Stammlösung benötigt wird berechnet ähnlich wie in Abschnitt 2.2 erwähnt. Die Methodik ist ähnlich, mit Ausnahme der AI wird in einer 10 Gew.% Honig aufgelöst: Wasser-Lösung. Diese Lösung sollte innerhalb von 24 Stunden nach der Einleitung der Bioassay durchgeführt werden. Wenn die technische Qualität Material ist nicht wasserlöslich, kann eine hohe Konzentration von Insektizid-Lösung mit Aceton so gemacht werden, dass nur eine kleine Menge des Insektizids: Aceton-Gemisch, um den Honig wird angefügt: Wasser Lösung 4. 2,3 Festlegung einer Reihe von Konzentrationen und Entwicklung Konzentrationen Die Bestimmung der geeigneten Konzentrationen nötig, um die Bandbreite der Antworten für die Biotest herstellen kann schwierig sein. Mehrere Wiederholungen erforderlich sein, um die verschiedenen Konzentrationen zu definieren und diese wird durch Versuch und Irrtum. Darüber hinaus kann der Bereich im Laufe der Zeit ändern, wenn die Bevölkerung ändert Ebenen der Empfänglichkeit. Zahlreiche andere Faktoren bei der Festlegung Endkonzentrationen in Betracht gezogen werden und beinhalten: Familie von Insekten, Klasse von Insektiziden, die Größe von Insekten, etc. Bisher veröffentlichte Ergebnisse von erwachsenen Fläschchen Tests können mit der Auswahl des Insektizid-Konzentrationen zu unterstützen. Thripidae 15; Coleoptera: Brentidae 16, Curculionidae 17, Coccinellidae 18-19 und Cybocephalidae 19; Diptera: Culicidae;: Hemiptera: Thysanaptera Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, Pentatomidae 8-10 und 11-14 Miridae Bioassays wurden für veröffentlichte 20; Lepidoptera: Noctuidae Tortricidae 21 und 3, 22-26; Hymenoptera: Braconidae 7,18, Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, Encyrtidae 7 und Aphelinidae 18. Die Konzentrationen sind auf "X" pg / ml-Lösung. Allerdings, wenn Fläschchen für die Erwachsenen Fläschchen Test bereit sind, werden nur 0,5 ml zu jedem Fläschchen gegeben werden, daher ist die Konzentration des Fläschchens die Hälfte der Konzentration hergestellt. Sobald Konzentrationen sind so gewählt, kann die folgende Gleichung zur Ermittlung der Höhe der Lösung behilflich hinzugefügt, um die gewünschte Konzentration zu machen. (C1) (V1) = (C2) (V2) Wo C1 ist die Konzentration der Stammlösung; V1 ist das Volumen der Lager erforderlich, um die neue Konzentration zu machen; C2 ist die Konzentration in Vorbereitung, und V2 ist das Volumen der neuen Konzentration. Zum Beispiel ist 5mls einer 100μg/ml Stammlösung benötigt, um eine 100mls einer 5μg/ml machen. Diese 5μg/ml Lösung wäre in Fläschchen mit einer Konzentration von 2.5μg/vial beschichtet führen. 5mls = [(5μg/ml) (100mls)] / (100μg/ml) 2.3.1 Adult Vial Test für Contact Insektizide Teilweise füllen volumetrische Flaks und aliquoten die berechnete Menge an Stammlösung notwendig, um die gewünschte Konzentration zu machen. Füllen Sie den Messkolben mit Aceton zum Teilstrich und fahren Sie mit Abschnitt 2.4 oder Abdichtung mit Parafilm M (Alcan Inc, Neenah, WI) für die Lagerung im Kühlschrank für die spätere Verwendung. Die meisten Lösungen sind gut für 1 Monat. 2.3.2 Änderung der Adult Vial-Test für systemische Insektizide Dieser Prozess ist die gleiche wie zuvor in 2.3.1 mit Ausnahme einer 10 Gew.% Honig erwähnt: Wasser-Lösung ist für Aceton ersetzt. Mix genug Honig: Wasser-Lösung, um alle gewünschten Konzentrationen zu machen. Diese Lösungen sollten innerhalb von 24 Stunden nach der Zubereitung verwendet werden. 2.4 Herstellung von Vials 2.4.1 Adult Vial Test für Contact Insektizide Wenn die Konzentrationen im Kühlschrank gelagert wurden, lassen auf Umgebungstemperatur erwärmen. Das Volumen von Aceton Änderungen basierend auf der Temperatur, die das Insektizid-Konzentration beeinflussen können. Farbcode 20 ml Glasfläschchen (ausgerüstet für Schraubverschlüsse) in Konzentrationen, mit Farbe oder Marker. Stellen Sie ein sich wiederholendes Pipette zu 0.5ml/concentration liefern. Initiieren Sie arbeiten mit Aceton Kontrolle nach mit der niedrigsten Konzentration und Weiterbildung mit steigenden Konzentrationen bis alle Konzentrationen verwendet wurden. Füllen Sie ungefähr die Hälfte des Volumens der Lösung als die tatsächliche Anzahl der Fläschchen zu behandelnden (dh 20mls für 40 Ampullen) in ein kleines Becherglas. Wenn die Lösung nicht in Gebrauch ist, decken Sie sie, um die Verdampfung, welche Änderungen in der Konzentration führen kann minimiert werden. Zeichnen Sie das Insektizid-Lösung in den sich wiederholenden Pipette und verzichten 0.5ml Lösung in einzelnen Glas-Fläschchen. Unmittelbar nach der Behandlung werden die Glasflaschen auf einem kommerziellen Hot Dog Rollen gebracht. Da die Walzen drehen, drehen Glasfläschchen und das Aceton verdampft und das Innere der Flasche mit der Technik beschichtetal grade Insektizid. Wärme kann sich verschlechtern, Insektizid, daher ist es für die Wärme aus zu sein wichtig. Dies kann entweder durch Abschalten des Heizelementes auf einem Modell, und heizt Rollen gleichzeitig und wird von den gleichen Switch oder über ein Modell der Hot-Dog-Rolle, die unabhängig voneinander funktionieren hat Schalter für das Heizelement und Rollen gesteuert erfolgen. Vermeiden Sie die Behandlung mehr Flaschen als die Rolle hält; das Aceton verdampfen kann, bevor die Glasfläschchen gedreht werden und sie können nicht erhalten eine gleichmäßige Beschichtung auf dem Fläschchen Wänden. Lassen Sie das Fläschchen zu drehen, bis alle Aceton verdampft ist. Es gibt vielleicht eine feine Schicht von Aceton-Kondensation auf dem Fläschchen Wänden, daher müssen Fläschchen einzeln untersucht werden. Dauer Ampullen je nach Laborbedingungen rollen. Sobald die Ampullen sind trocken, Kappe und speichert sie entweder gekühlt oder in dunkler Umgebung. Insekten wurden an den Lidern beobachtet Ruhe mit konischen Liner oder zerrissene Folie Liner, die unterhalb der Lippe der Flasche (dh Vermeidung von behandelten Oberflächen) hängen, deshalb ist es wichtig, un-gesäumt Deckel verwenden. Alle verbleibenden Lösung nicht verwendet werden, um Fläschchen vorbereiten sollten ordnungsgemäß entsorgt werden. Die verbleibende Lösung in den Meßkolben mit Parafilm versiegelt und im Kühlschrank aufbewahrt. Datum, an dem Fläschchen, wenn sie bereit sind, weil verschiedene Insektizide unterschiedlichen Haltbarkeiten haben. Zum Beispiel sind Pyrethroid-beschichtete Röhrchen gut für ungefähr einen Monat, während Fläschchen mit einer instabilen Insektizid überzogen, wie ein Organophosphat, haben Haltbarkeit von zwei Wochen oder weniger. 2.4.2 Modifizierte Adult Vial-Test für systemische Insektizide Floral-Schaum wird benötigt, um als Substrat für die Bereitstellung des Insektizids Lösung für Insekten 4 dienen. Cut Steckschaum (12mm x 12mm) Stück mit einem Korkbohrer. Legen Sie ein Stück Steckschaum in das Glasfläschchen zuvor beschrieben. Füllen Sie das wiederholen Pipette angepasst, um 0,5 ml Lösung zu liefern und verzichten auf die Steckschaum. Das Volumen der Flüssigkeit sollte sättigen das Stück Steckschaum, sollte aber nicht höher sein als der Schaum in der Flasche. Auch in Folge der Arbeit von der Steuerung (10 Gew.% Honig: Wasser-Lösung nur) und der niedrigsten bis zur höchsten Konzentrationen. 2.5. Speichern Vials 2.5.1 Adult Vial Test für Contact Insektizide Bei der Lagerung von Insektiziden beschichtete Fläschchen, wissen die Eigenschaften des Insektizids. Verschiedene Insektizide haben unterschiedliche Storage-Anforderungen wie zB: Pyrethroide sind lichtempfindlich und kann bei Raumtemperatur, sondern im Dunkeln gelagert werden, jedoch sind Organophosphat-Insektiziden temperaturempfindlich und müssen in einem Gefrierschrank gelagert werden. Wenn Insektiziden erforderlich sind, um in der Tiefkühltruhe gelagert werden, müssen sie auf Raumtemperatur vor der Belichtung die Insekten erwärmt werden. 2,6 Bioassay Sammeln Sie die Insekten getestet werden. Dieser Prozess kann mit Pheromon-Köderfallen, sweep Netze oder andere Mittel der Massenkommunikation zu erfassen. Insekten sollten für 8-24h gehalten werden, um für die natürliche Sterblichkeit um für die während der Entnahme Verletzten auftreten können; bieten ihnen Nahrung und Feuchtigkeit Quelle in diesem Zeitraum. Testen 10-25 Insekten pro Konzentration (10 minimum); je größer die Zahl der Insekten getestet, desto robuster der Daten festgelegt wird. Bei der Auswahl der Insekten für den Bioassay, wählen Sie gesunde, aktive Personen und entsorgen lethargisch oder abnorme Individuen. Legen Insekten in den Fläschchen, so dass sie das gesamte Spektrum der Konzentrationen und nicht nur eine Konzentration in einer Zeit ausgesetzt sind. Dieses Verfahren wird verhindern, dass die meisten gesunden und aktiven Personen in einem oder wenigen Konzentrationen. Außerdem, wenn es nicht möglich ist, das Experiment mit einem Minimum von 10 Tieren pro Konzentration durchzuführen, setzen so viele wie möglich, jede Konzentration. Dann sammeln mehr Insekten aus der gleichen Probe Gebiet innerhalb kurzer Zeit (2-3 Wochen) und wiederholen das Experiment. Einige Insekten können die Anfälligkeit (build Widerstand), da die Pflanzen Saison fortschreitet verlieren, daher die Reaktion der Menschen im Frühjahr gesammelt werden können, unterscheiden sich von denen im Herbst 28 gesammelt. Entwickeln Sie Kriterien, um die Sterblichkeit zu beurteilen. Die am häufigsten verwendeten Kriterien für die Insekten als sterbende oder tote klassifizieren sind ein Mangel an koordinierter Bewegung. Diese Beobachtungen können auch die Unfähigkeit, Recht selbst wenn auf seiner dorsalen Oberfläche gelegt, nicht koordinierten Flug von 1m oder Fehlen einer koordinierten Bewegung, wenn Sie vorsichtig mit einem stumpfen Instrument stieß aufrecht zu erhalten. Wenn das Recht des Einzelnen selbst, sondern fällt, kann über gibt es keine koordinierte Bewegung; das Insekt sollte als tot sein. Das Insekt kann es zu Schwierigkeiten aufrichtende sich auf eine glatte Oberfläche, daher ist es vielleicht notwendig, liefern das Insekt eine Oberfläche, so dass es in der Lage, die Traktion erforderlich, Recht selbst zu gewinnen. Rekorddie Zahl der Überlebenden und Toten Personen, die Überlebensrate für jede Konzentration zu berechnen. 2.6.1 Adult Vial Test für Contact Insektizide Legen Sie das Insekt (s) in das Fläschchen und sichern Sie die Kappe lose. Der Deckel muss das Insekt der Flucht zu hindern, aber locker genug sein, um den Luftstrom zu ermöglichen. Für die meisten Insekten Bioassays, ist nur ein Insekt in jedem Fläschchen gestellt, aber kleine Insekten, wie zB Weiße Fliegen oder Thripse, kann mit einer Geschwindigkeit von bis zu 30 Individuen pro Flasche 6, 15 ausgesetzt werden. Legen Sie die Fläschchen aufrecht bei Raumtemperatur, bis die Insekten für die Mortalität bei den Endpunkt der Bioassay bewertet werden. Die Belichtungszeiten können mit Arten und möglicherweise das Insektizid 3,5-27 abweichen. In den Prozess der Gründung anfänglichen Toxizität mit einer neuen Insekten-oder Chemie-, überwachen die Fächer an mehreren geplanten Zeitpunkten nach der Exposition. Prüfungen können beendet werden, wenn die Sterblichkeit bei der höchsten Konzentration 100% ist aber weiterhin hohe Überlebensrate (<10% Mortalität) in der Nicht-Insektizid behandelt zu kontrollieren. Wenn 100% Mortalität ist nicht bei der höchsten Konzentration mit hoher Überlebensrate in der Kontrollgruppe erreicht, sollte die Bioassay unter Verwendung einer Reihe von höheren Konzentrationen werden. Idealerweise sollte Sterblichkeitsraten als Insektizid-Konzentration zunimmt. Einige Insekten, wenn sie für 24 Stunden ausgesetzt, erfordern eine Quelle von Feuchtigkeit (dh ein kleines Stück von pflanzlichem Material) 12. Beim Arbeiten mit einem zarten Insekten, ist es von Vorteil, um zu bestimmen, wie lange das Insekt kann in der Flasche, ohne eine Quelle der Feuchtigkeit vor der Insektizid-Exposition in der erwachsenen Fläschchen Test überleben. Diese Informationen können, indem sie das Insekt in einem Fläschchen mit und ohne Feuchtigkeit Quell-und Monitoring sein Überleben im Laufe der Zeit vor der Durchführung der tatsächlichen Insektizid Umfragen ermittelt werden. 2.6.2 Modifizierte Adult Vial-Test für systemische Insektizide Vor Beginn des Bioassays, festzustellen, ob das Insekt ernähren können und auf Steckschaum mit dem Honig gesättigt zu überleben: Wasser-Lösung in Abwesenheit von Insektiziden. Wasser nur (oder Honig:: Wasser mit dem größten Volumen an Aceton in Vorbereitung Konzentrationen mit nicht-wasserlöslichen technisch verwendeten Insektizids) Ort Insekten in Fläschchen mit Steckschaum mit Honig gesättigt und überwachen Überlebensrate für einige Tage. Diese Modifikation der erwachsenen Fläschchen Test hat nur mit einem Miridae 4 und eine Pentatomidae 29 Jahren untersucht, daher die Bestimmung der Dauer des Tests erfordert mehr Versuche als für den Kontakt Insektizid Bioassay. Zum Beispiel wurde Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) für die Mortalität bei 24 Stunden nach der Exposition gegenüber Thiamethoxam beurteilt, aber 72 Stunden für Imidacloprid 4. Die Sterblichkeit von Oebalus pugax F. wurde auf 96 Stunden beurteilt, wenn sie Dinotefuran 29 ausgesetzt. Daher müssen Insekt Überleben in Kontrollfläschchen werden gleichbleibend hohe mehrere Tage, bevor eine genaue Sterblichkeit Rating von Insektizid Rausch gemacht werden kann. Legen Sie das Insekt (s) in die Scintillationsfläschchen mit dem gesättigten Steckschaum. Statt Versiegelung der Fläschchen mit Deckel, Dichtung Fläschchen mit einem Wattebausch. Legen Sie die Fläschchen aufrecht bei Raumtemperatur, bis die Insekten für die Mortalität beurteilt werden. Wie bereits erwähnt, bewerten die Sterblichkeit in regelmäßigen Abständen. Prüfung kann beendet werden, wenn es 100% Mortalität bei der höchsten Konzentration mit hoher Überlebensrate (<10% Mortalität) in der Steuerung. Es kann notwendig sein, zusätzliche Konzentrationen zu testen. 2.6.3 Data Analysis Korrigieren Sie die Mortalität in den Kontroll-Behandlung mit einer Formel nach Abbott 30. Korrigierte Mortalität (%) = ((% Überlebensrate Kontrolle -% ige Überlebensrate, behandelt) /% Überleben control) x 100 Analysieren von Daten mit log Dosis Probit die tödliche Konzentration erforderlich, um 50% der Bevölkerung (LC 50) zu töten und zu etablieren 95% Konfidenzintervall (CL) zu bestimmen. Mehrere Software-Programme stehen dem LC 50 (SAS: PROC PROBIT 31, Polo-Plus 32) zu bestimmen. 3. Hinweise Die Arbeit mit Aceton und Insektizide unter einem Negativ-flow Luft Kapuze. Beim Ausfüllen Messkolben, ist es am besten mit zwei Waschflaschen von Aceton zu haben. Eine Waschflasche, die für eine schnelle Lieferung von Flüssigkeiten und eine für langsame Lieferung angepasst wurde. Nehmen Sie Teil der Lieferung Arm, um eine größere Öffnung zu schaffen und diese Flasche kann für die Lieferung einer großen Menge verwendet schnell. Nachdem das Aceton nähert, um die Graduierung Linie, ändern Flaschen und nutzen Sie die Waschflasche mit langsameren Lieferung, so dass Sie mehr Kontrolle über die Menge, die verzichtet haben. Wenn ein Kolben über dem Teilstrich gefüllt ist, lassen Sie den Deckel und lassen Aceton zum Teilstrich verdampfen. </ Li> Beachten Sie die Menge der Stammlösung benötigt, benötigt, um eine Konzentration, dh Vorbereitung, wenn Sie den Kolben ¾ dem Weg, aber ausfüllen müssen, um hinzuzufügen 30mls, können Sie über Teilstrich gehen.