Bioassays עבור ההתנגדות הדברה ניטור

1. הקדמה ייצור המזון הפך להיות בעל חשיבות עליונה עם ההכרה כי עד 2025 יגיע העולם אוכלוסייה של אנשים 8040000000 1. לא יהיה צורך לספק כמות גדולה של יבולי מזון מאשר מיוצר כיום. זמינות מזון הולם לא יהיה מסוגל ללא שימוש של מוצרים להגנת צמחים כגון חומרי הדברה כדי להגדיל את כמות היבולים ואת לשמור על האיכות. בהתבסס על הסתמכות ההיסטורי הנוכחי על חומרי הדברה, חומרי הדברה מקרים של התנגדות ימשיכו להתרחש להיות מדווח בספרות המדעית. עמידות לחומרי הדברה מזיקים היא בעייתית כי המוצרים הם מרכיב בלתי נפרד של חקלאות מניבים גבוהה איכות הייצור. עם זאת, ועל יתר / או ניצול לרעה של חומרי הדברה יכולים להוביל לפיתוח של התנגדות אשר יכול להזיק ייצור היבול. מזיקים (כלומר, חרקים, עשבים שוטים, פתוגנים, וכו ') לפתח עמידות על ידי מגוון של מנגנונים, אלא גורם מניע מרכזי להתפתחות עמידות הוא היעדר חומרי הדברה רשום 1 עם מצבי תלות פעולה זמינים לשימוש. כאשר מספר מוצרים מסומנים עבור הדברה בודד בתוך מערכת יבול בפרט, אפשרויות שליטה כימית מוגבלים. לכן, כימי זהה (ים) משמש שוב ושוב, בלחץ מתמיד מבחר מושם על הדברה. בעיה זו מחריפה כאשר הדברה יש מספר דורות בשנה אחת וכל הדור חשוף לחומרי הדברה. יש גם עלויות פיננסיים enrivornmental הקשורים התנגדות 2. התנגדות בפשט מוביל לשיעור גבוה ויישומים תכופים יותר של חומרי הדברה נדרש להשיג שליטה מספקת. הפסדי תשואה צפויים להופיע גם לאחר הגדלת השימוש בחומרי הדברה עקב אי שליטה הדברה היעד. פימנטל 2 הערכות אלה עלויות של חומרי הדברה התנגדות ב שמאחד בארצות להיות כ -1.5 מיליארד דולר בשנה. סקרים בקרב אוכלוסיות רגישות לחומרי הדברה מזיקים היא גישה פרואקטיבית לזהות כל שינוי בביצועים הדברה לספק אזהרה מוקדמת לשנות אסטרטגיות בקרה כימיים. על ידי שינוי אסטרטגיות IPM הכוללת, לקיומה של חומרי הדברה מסוים עשוי להיות ממושך, אשר בתורו, חשוב לחקלאות להמשיך לספק מזון מספיק סיבים תזונתיים ועל העולם. מאמר זה יתאר פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לפקח על הרגישות הדברה לזהות התפתחות של חרקים עמידים אוכלוסיות באמצעות מבחן למבוגרים בקבוקון 3 עבור הדברה קשר שינוי של בדיקה זו עבור הדברה צמח מערכתית 4. 2. שיטות 2.1 הצהרת בטיחות באמצעות אמצעי בטיחות נאותה חשוב בהתמודדות עם חומרי הדברה. עיין בטיחות חומרים גיליון נתונים (MSDS) עבור ציוד מגן אישי מתאים (PPE) לפני הטיפול בחומרי הדברה. הכשרה מעבדה ספציפיות על טיפול בחומרי הדברה במעבדות צריך להיות נדרש על ידי אנשי לפני שתנסה כל bioassays. 2.2 מלאי ביצוע הפתרון לפתח פתרון המניות של ריכוז ידוע ממקור של המרכיב הפעיל הדברה (AI). כל הריכוזים הרצוי נכלל טיפולים המבדק יבוצע מפתרון המניות המקורי. עבור האינטרס של מאמר זה, 100mls פתרון מיקרוגרם / מ"ל ​​100 יפותח כפתרון המניות, אולם ריכוז כל יכול להיות מדולל מתוך ריכוז זה הראשונית. התאם את כמות AI כיתה טכני להישקל מבוסס על טוהר אחוזים. סכום להישקל = (נפח לעשות) X ([# מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון] / [purity/100%]) כך, למשל, ידרוש 10152.284 מיקרוגרם של AI טכנית לבצע 100 MLS של פתרון מיקרוגרם / ml 100 של הדברה כיתה טכני של טוהר 98.5%: (100 מ"ל) X ([100μg/ml] / 0.985) = 10152.284 מיקרוגרם 2.2.1 Vial למבוגרים מבחן חרקים צור חלקית למלא בעדינות בקבוק מדידה עם אצטון לשקול את סכום מותאם של AI הדברה. לשטוף את הסירה משקל עם אצטון לתוך הבקבוק כדי להסיר את כל החרקים מהסירה לשקול את. מלאו את הבקבוק volumetric לקו הסיום עם אצטון. רוב הפתרונות שנערך בתנאי קירור תקיים פעילות ללא איבוד ניכר של יעילות במשך כחודש. 2.2.2 שינוי של מבחן Vial למבוגרים חרקים מערכתית שיכרון חרקים עם חומרי הדברה מערכתי שונה במובהק מזו של מוצרים ליצירת קשר. המוצרים בדרך כלל מערכתית חייבת להיות ingested על ידי החרק להיות פעיל במקום החרק שיש exposur ישירדואר למוצר כמו חומרי הדברה קשר. לכן, לבחון את הבקבוקון מבוגר שונה על מנת הדברה מערכתית להיבדק. המשקל של AI הנדרשת עבור פתרון המניות מחושב דומה לזה המוזכר בסעיף 2.2. מתודולוגיה דומה, למעט AI הוא מומס 10% על ידי דבש משקל: פתרון המים. פתרון זה אמור להתבצע בתוך 24 שעות חניכה של המבדק. אם החומר בכיתה טכני אינו מסיס במים, ריכוז גבוה של פתרון הדברה יכולה להתבצע באמצעות אצטון כזה רק נפח קטן של החרקים: תערובת אצטון מתווסף הדבש: הפתרון מים 4. 2.3 ריכוזים קביעת טווח של ריכוזים והמתפתחות קביעת ריכוזי המתאים הדרוש כדי להקים את טווח התגובות עבור המבדק יכולים להיות קשים. משוכפלים כמה עשוי להיות נחוץ כדי להגדיר את טווח הריכוזים וזה נעשה על ידי ניסוי וטעייה. בנוסף, הטווח יכול להשתנות עם הזמן אם האוכלוסייה משתנה רמות הרגישות. גורמים נוספים רבים יש לשקול הקמת ריכוזים הסופית כוללים: משפחה של חרק, מחלקה של חרקים, בגודל של חרקים, וכו 'שפורסם בעבר תוצאות של בדיקות בקבוקון מבוגר יכול לסייע עם הבחירה הראשונית של ריכוזי חומרי הדברה. Bioassays פורסמו עבור: Hemiptera: Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, Pentatomidae 8-10 ו 11-14 Miridae; Thysanaptera: Thripidae 15; Coleoptera: Brentidae 16, Curculionidae 17, 18-19 ו Coccinellidae Cybocephalidae 19; Diptera: Culicidae 20; הפרפרים: Tortricidae 21 ו Noctuidae 3, 22-26; דבוראים: Braconidae 7,18, Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, Encyrtidae 7 ו Aphelinidae 18. ריכוזים מתקבלות על בסיס מיקרוגרם "X" / פתרון מ"ל. עם זאת, כאשר בקבוקונים מוכנים לבדוק את הבקבוקון מבוגר, רק 0.5ml יתווספו בקבוקון אחד, ולכן הריכוז של הבקבוקון הוא חצי ריכוז גרם. לאחר ריכוזי נבחרים, המשוואה הבאה יכולה לסייע בקביעת סכום פתרון נוסף על מנת להפוך את הריכוז הרצוי. (C1) (V1) = (C2) (V2) איפה C1 הוא ריכוז פתרון המניות; V1 הוא נפח של המניה צריכה לעשות את הריכוז החדש; C2 הוא הריכוז שמכינים; ו V2 הוא נפח הריכוז החדש. לדוגמה, 5mls פתרון מניות 100μg/ml יש צורך לעשות 100mls של 5μg/ml. זה פתרון 5μg/ml תביא צלוחיות מצופה בריכוז של 2.5μg/vial. 5mls = [(5μg/ml) (100mls)] / (100μg/ml) 2.3.1 Vial למבוגרים מבחן חרקים צור חלקית למלא פלקס volumetric, ו aliquot הסכום המחושב של פתרון המניות הדרושות כדי להפוך את הריכוז הרצוי. מלאו את הבקבוק volumetric עם אצטון לקו הסיום ולהמשיך סעיף 2.4 או חותם עם Parafilm M (Alcan Inc, Neenah, WI) לאחסון במקרר לשימוש מאוחר יותר. רוב פתרונות טובים במשך חודש 1. 2.3.2 שינוי של מבחן Vial למבוגרים חרקים מערכתית תהליך זה זהה כאמור, למעט 10% על ידי דבש במשקל 2.3.1: פתרון המים להחליף אצטון. מערבבים דבש מספיק: פתרון מים כדי להפוך את כל ריכוזי הרצוי. פתרונות אלה יש להשתמש תוך 24 שעות של הכנה. 2.4 הכנת צלוחיות 2.4.1 Vial למבוגרים מבחן חרקים צור אם הריכוזים היו מאוחסנים במקרר, לאפשר לחמם לטמפרטורת הסביבה. היקף השינויים אצטון מבוסס על טמפרטורה אשר יכולים להשפיע על ריכוז חרקים. צבע 20 מ"ל צלוחיות זכוכית קוד (המותאם כמוסות בורג) עבור ריכוזי באמצעות צבע או סמנים. התאם pipettor חוזרת לספק 0.5ml/concentration. התחל לעבוד עם שליטה אצטון, הבאים עם הריכוז הנמוך והמשך הגדלת ריכוזי עד שכל הריכוזים היו בשימוש. יוצקים כ נפח מחצית הפתרון כמספר בפועל של צלוחיות לקבל טיפול (כלומר, 20mls עבור 40 צלוחיות) בכוס קטנה. כאשר הפתרון אינו בשימוש, לכסות אותו כדי למזער את אידוי אשר יכול לגרום שינויים בריכוז. צייר את הפתרון הדברה לתוך pipettor החוזר ולחלק פתרון 0.5ml לתוך צלוחיות זכוכית בודדים. מיד לאחר הטיפול, צלוחיות זכוכית מונחות על רולר כלב מסחרי חם. כפי להפוך הגלילים, צלוחיות זכוכית לסובב מתאדה אצטון, עוזב את החלק הפנימי של הבקבוקון מצופה הדברה ציון טכנית. מחממים יכול דegrade הדברה, ולכן חשוב בחום ללכת. זה יכול להיעשות גם על ידי ניתוק גוף החימום על מודל זה מחמם ולחמניות בו זמנית נשלטת על ידי מתג זהה או באמצעות מודל של רולר נקניקיות שיש לו תפקוד עצמאי מתגים עבור גוף החימום רולים. הימנע בטיפול בקבוקונים יותר מכבש מחזיקה; אצטון עשוי להתאדות לפני צלוחיות זכוכית הם מסובבים והם לא יכול לקבל ציפוי אפילו על קירות בקבוקון. אפשר צלוחיות כדי לסובב עד אצטון כל התאדו. אולי יש שכבה דקה של עיבוי, אצטון על הקירות הבקבוקון, ולכן צלוחיות צריך להיבחן בנפרד. הזמן הדרוש כדי לגלגל צלוחיות משתנה מבוססת על בתנאי מעבדה. לאחר צלוחיות הם כובע יבש, או לאחסן אותם בתנאים מצוננים או כהה. חרקים נצפו נחים על העפעפיים עם ספינות חרוטי או ספינות נייר קרוע כי לתלות מתחת לשפה של הבקבוקון (כלומר, הימנעות משטחים מטופלים), ולכן חשוב להשתמש בלתי מצופה העפעפיים. כל פתרון הנותרים לא נעשה שימוש כדי להכין צלוחיות צריך להיות מסולק כראוי. הפתרון הנותרים הבקבוק volumetric יכול להיות חתום Parafilm ולאחסן במקרר. תאריך צלוחיות כאשר הם מוכנים, כי חומרי הדברה שונים יש חיי מדף שונים. לדוגמה, pyrethroid מצופה צלוחיות טובים כחודש ואילו צלוחיות מצופה הדברה יציבים יותר, כמו organophosphate, יש חיי מדף של שבועיים או פחות. 2.4.2 השתנה Vial למבוגרים מבחן חרקים מערכתית קצף פרחוני נדרש לשמש מצע לאספקת הפתרון הדברה לחרקים 4. גזור קצף פרחוניים (X 12mm 12mm) חתיכות באמצעות מקדח הפקק. מניחים פיסת קצף פרחוני לתוך צלוחיות זכוכית שתואר לעיל. מלאו את pipettor לחזור מותאם לספק פתרון 0.5ml ו לוותר על הקצף פרחוני. זה נפח הנוזל צריך להרוות את פיסת קצף פרחוני, אבל לא יעלה את הרמה של קצף של הבקבוקון. שוב לעבוד ברצף משליטת (10% על ידי דבש משקל: פתרון מים בלבד), מהנמוך ביותר לגבוה ביותר ריכוזי. 2.5. אחסון צלוחיות 2.5.1 Vial למבוגרים מבחן חרקים צור בעת אחסון צלוחיות הדברה מצופה, לדעת את התכונות של חומרי הדברה. חומרי הדברה שונים יש דרישות אחסון שונים כגון: pyrethroids קלים רגיש ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, אבל בחושך, עם זאת, הדברה organophosphate הם טמפרטורה רגיש צריך להיות מאוחסן במקפיא. אם הדברה נדרשים לאחסן במקפיא, הם חייבים להיות מחומם לטמפרטורת החדר לפני חשיפת חרקים. 2.6 המבדק איסוף חרקים להיבדק. תהליך זה יכול להיעשות באמצעות פרומון-התגרה מלכודות, רשתות לטאטא, או בכל אמצעי אחר של לכידת המוני. חרקים צריך לקיים עבור 8-24h כדי לאפשר תמותה טבעית להתרחש הפצועים בתהליך איסוף, לספק להם מזון מקור לחות במהלך תקופה זו. מבחן 10-25 חרקים לכל ריכוז (10 מינימום); גדול יותר מספר של חרקים נבדק, חזק יותר את מערכת הנתונים יהיה. בעת בחירת חרקים עבור המבדק, בחר בריאים, אנשים פעילים להשליך אנשים רדום או לא נורמלי. המקום חרקים בתוך מבחנות כך הם נחשפים מגוון רחב של ריכוזי ולא רק אחד הריכוז בכל פעם. הליך זה ימנע הצבת אנשים בריאים הכי פעיל אחד או כמה ריכוזים. בנוסף, אם לא ניתן לבצע את הניסוי עם מינימום של 10 חרקים בכל ריכוז, לחשוף רבים ככל האפשר כדי ריכוז אחד. ואז לאסוף את החרקים יותר מאזור מדגם זהה תוך זמן קצר (2-3 שבועות) וחזור על הניסוי. חרקים מסוימים יכול לאבד את הרגישות (לבנות התנגדות) עם התקדמות העונה היבול, ולכן התגובה של אנשים שנאספו בתחילת האביב עשויים להיות שונים מאלה שנאספו בסתיו 28. לפתח קריטריונים להערכת התמותה. הקריטריונים הנפוצים ביותר בשימוש לסווג חרקים כמו גוסס או מת הם חוסר תנועה מתואמת. תצפיות אלה עשויות לכלול חוסר היכולת לתקן את עצמו אם מונח על משטח הגב שלה, לא מסוגל לקיים את הטיסה מתואמת של 1m או חוסר תנועה מתואמת כאשר דחף בעדינות עם מכשיר קהה. אם האדם יכול לתקן את עצמו, אך נופל, אין תנועה מתואמת; החרק צריך להיחשב מת. חרקים עלולים לחוות קשיים שהתיישר על משטח חלקלק, ולכן יש צורך אולי לספק את החרק משטח, כך הוא מסוגל לקבל את המתיחה צורך הזכות עצמה. רשום את מספרניצולים ואנשים מתים כדי לחשב את שאירים עבור כל הריכוז. 2.6.1 Vial למבוגרים מבחן חרקים צור מניחים את החרק (ים) לתוך הבקבוקון ולאבטח את כובע רופף. המכסה צריך למנוע את החרק לברוח, אבל להיות משוחרר מספיק כדי לאפשר זרימת אוויר. עבור bioassays חרקים ביותר, רק אחד חרק ממוקם בקבוקון אחד, עם זאת, חרקים קטנים, למשל whiteflies או תריפסים, עלול להיות חשוף בשיעור של כ -30 אנשים לכל בקבוקון 6, 15. מניחים את בקבוקוני זקוף בטמפרטורת החדר עד החרקים מוערכים לתמותה בכל נקודת הקצה של המבדק. פעמים חשיפה עשוי להשתנות עם מינים ואולי הדברה 3,5-27. בתהליך של קביעת רמות רעילות ראשוני עם חרק או כימי חדש, לפקח על נושאים על מספר נקודות זמן מתוכנן לאחר החשיפה. בחינות ניתן להפסיק כאשר התמותה בריכוז הגבוהה ביותר הוא 100% תוך שמירה שאירים גבוהה (<התמותה 10%) בשליטה הדברה שאינם מטופלים. אם התמותה 100% לא מושגת בריכוז הגבוה ביותר עם שאירים גבוהה שליטה, המבדק יש לחזור באמצעות מגוון של ריכוזים גבוהים יותר. באופן אידיאלי, רמות התמותה צריך להגדיל את מגביר את ריכוז חומרי הדברה. חרקים מסוימים, כאשר הם נחשפים ל -24 שעות, דורשים מקור של לחות (כלומר, פיסה קטנה של חומר צמחי) 12. כאשר עובדים עם חרק עדין, זה מועיל כדי לקבוע כמה זמן החרק יכול לשרוד הבקבוקון ללא מקור של לחות לפני החשיפה הדברה במבחן את הבקבוקון מבוגר. מידע זה יכול להיקבע על ידי הצבת חרק בקבוקון עם ובלי מקור לחות ניטור ההישרדות שלה לאורך זמן לפני ביצוע סקרים הדברה בפועל. 2.6.2 למבוגרים השתנה Vial מבחן חרקים מערכתית לפני תחילתו של המבדק, לקבוע אם החרק יכול להאכיל ולשרוד על קצף פרחוני רווי הדבש: הפתרון מים בהיעדר הדברה. חרקים מקום צלוחיות עם קצף פרחוני רווי דבש: מים בלבד (או דבש: מים עם נפח גדול אצטון המשמש בהכנת חומרי הדברה בריכוזים עם ציון הלא מסיסים במים טכני) ולפקח שאירים במשך כמה ימים. שינוי זה של הבדיקה בקבוקון מבוגר יש רק נבדקו עם Miridae 4 ו Pentatomidae 29, ולכן קביעת משך הבדיקה דורשת ניסויים יותר עבור המבדק החרקים קשר. לדוגמה, Lygus lineolaris (Palisot דה Beauvois) הוערכה לתמותה ב 24 שעות לאחר החשיפה thiamethoxam, אבל 72 שעות imidacloprid 4. התמותה של Oebalus pugax פ הוערכה ב 96 שעות כאשר הם נחשפים dinotefuran 29. לכן, שאירים חרק צלוחיות השליטה חייבת להיות גבוהה באופן עקבי במשך כמה ימים לפני הדירוג התמותה מדויק של שיכרון הדברה יכול להתבצע. מניחים את החרק (ים) לתוך בקבוקון הנצנץ עם קצף פרחוני רווי. במקום איטום צלוחיות עם מכסים, חותם צלוחיות עם כדור צמר גפן. מניחים את בקבוקוני זקוף בטמפרטורת החדר עד החרקים מוערכים לתמותה. כאמור, שיעור התמותה במרווחי זמן קבועים. בחינת ניתן להפסיק כאשר יש 100% תמותה בריכוז הגבוה ביותר עם שאירים גבוהה (<התמותה 10%) בשליטה. זה עשוי להיות נחוץ כדי לבדוק ריכוזים נוספים. 2.6.3 ניתוח נתונים נכון לתמותה בטיפול לשלוט באמצעות נוסחה על פי אבוט 30. תמותה מתוקן (%) = ((הישרדות לשלוט% – הישרדות% מטופלים) / הישרדות לשלוט%) x 100 ניתוח נתונים באמצעות מנה probit התחבר כדי לקבוע את ריכוז קטלני נדרש להרוג 50% מהאוכלוסיה (LC 50) ולהקים במרווחי ביטחון של 95% (CL). תוכנות מרובים זמינים כדי לקבוע את LC 50 (SAS: PROBIT proc 31, פולו פלוס 32). 3. הערות עבודה עם אצטון הדברה מתחת למכסה המנוע שלילי זרימת האוויר. כאשר ממלאים צלוחיות volumetric, זה הכי טוב שיש שני בקבוקי לשטוף של אצטון. אחת לשטוף בקבוק הותאם עבור משלוח מהיר של נוזלים אחד למסירה איטי. הסר את החלק של הזרוע המסירה כדי ליצור פתח גדול יותר זה הבקבוק יכול לשמש אספקת כמויות גדולות במהירות. לאחר אצטון מתקרבת לקו הסיום, בקבוקי לשנות ולהשתמש בבקבוק לשטוף עם משלוח איטי, כך יש לך יותר שליטה על כמות שהוא חילק. אם בקבוק מלא מעל קו הסיום, להשאיר את המכסה ולאפשר אצטון להתאדות אל קו הסיום. הערה סכום לביתded הפתרון המניות, צריך להכין ריכוז, כלומר אם אתה ממלא את הבקבוק ¾ הדרך אבל צריך להוסיף 30mls, אתה יכול ללכת על קו הסיום.