Bioassays voor Monitoring Insecticide Resistance

1. Introductie De voedselproductie is er geworden van het grootste belang met het besef dat in 2025 de wereld een bevolking van 8,04 miljard mensen een te bereiken. Er zal de noodzaak om een ​​grotere hoeveelheid van voedingsgewassen het aanbod dan op dit moment geproduceerd worden. Voldoende beschikbaarheid van voedsel zal niet in staat zijn om zonder het gebruik van gewasbeschermingsmiddelen, zoals pesticiden om de kwantiteit van gewasopbrengsten te verhogen en de kwaliteit te handhaven. Gebaseerd op de historische en huidige afhankelijkheid van pesticiden, zullen gevallen van resistentie tegen pesticiden blijven zich voordoen en worden gerapporteerd in de wetenschappelijke literatuur. Plaagresistentie aan pesticiden is problematisch, omdat de producten zijn een integraal onderdeel van het hoge-opbrengst en een hoge kwaliteit productie van de landbouw. Echter, overmatig gebruik en / of misbruik van een bestrijdingsmiddel leiden tot de ontwikkeling van resistentie die kan schadelijk zijn voor gewassen. Ongedierte (dat wil zeggen, insecten, onkruid, pathogenen, etc.) te ontwikkelen weerstand door een verscheidenheid van mechanismen, maar een belangrijke drijvende factor voor de ontwikkeling van resistentie is het ontbreken van de geregistreerde pesticiden een met onafhankelijke werkingsmechanismen beschikbaar voor gebruik. Als er weinig producten zijn gelabeld voor een individuele plaag in een bepaald gewas systeem, zijn chemische bestrijdingsmiddelen opties beperkt. Daarom is het dezelfde chemische stof (fen) herhaaldelijk gebruikt en continue selectiedruk wordt geplaatst op de plaag. Dit probleem wordt nog verergerd als de pest heeft meerdere generaties in een jaar en elke generatie is blootgesteld aan het bestrijdingsmiddel. Er zijn zowel financiële als enrivornmental kosten in verband met Resistance 2. Plaagresistentie leidt tot hogere tarieven en meer frequente toepassingen van pesticiden nodig zijn om voldoende controle te bereiken. Opbrengstverliezen zijn waarschijnlijk zelfs optreden na het verhogen van het gebruik van bestrijdingsmiddelen worden omdat niet aan het doel ongediertebestrijding. Pimentel twee schattingen van deze kosten van pesticiden weerstand in de Verenigde Staten jaarlijks ongeveer $ 1,5 miljard. Enquêtes van pesticiden gevoeligheid onder de pest de bevolking is een proactieve benadering van een verschuiving in de insecticide prestaties op te sporen en geven een vroegtijdige waarschuwing voor chemische gewasbescherming strategieën te wijzigen. Door een wijziging van de algemene IPM strategieën, kan de levensvatbaarheid van een bepaald pesticide worden uitgebreid, wat op zijn beurt, is belangrijk voor de landbouw te blijven voldoende voedsel en vezels voor de wereld te bieden. Dit document beschrijft een protocol dat gebruikt kan worden om insecticide gevoeligheid gaten houden en detecteren de ontwikkeling van insecticide-resistente populaties met behulp van de volwassen flacon test 3 voor contact insecticiden en een wijziging van deze test voor de plant systemische insecticiden 4. 2. Methoden 2.1 veiligheidsverklaring Met behulp van de juiste voorzorgsmaatregelen is van belang bij het omgaan met insecticiden. Raadpleeg het Material Safety Data Sheet (MSDS) voor de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voordat u pesticiden. Specifieke laboratorium-opleiding over het omgaan met pesticiden in laboratoria moeten worden verplicht door het personeel voordat u een bioassays. 2.2 Het maken van Stock-oplossing Ontwikkelen van een voorraad oplossing van een bekende concentratie van een bron van insecticide actief bestanddeel (AI). Alle gewenste concentraties opgenomen als behandelingen in de bioassay zal worden gemaakt van de oorspronkelijke stam-oplossing. Voor het belang van dit artikel, 100mls van een 100 ug / ml, oplossing zal worden ontwikkeld als een stock-oplossing, maar kan elke concentratie verdund worden uit deze eerste concentratie. Pas de hoeveelheid van de technische kwaliteit AI worden gewogen op basis van het percentage zuiverheid. Bedrag dat moet worden afgewogen = (volume te maken) X ([# ng / ml, oplossing] / [% purity/100]) Bijvoorbeeld, zou het nodig zijn 10152.284 ug van technische AI ​​tot 100 ml van een 100 ug / ml oplossing van een technische kwaliteit insecticide van 98,5% zuiverheid te maken: (100 ml) X ([100μg/ml] / 0,985) = 10.152,284 microgram 2.2.1 Adult Vial test voor Contact insecticiden Gedeeltelijk te vullen een maatkolf met aceton en wegen het aangepaste bedrag van insecticide AI. Spoel het gewicht boot met aceton in de kolf om alle insecticide uit de wegen boot. Vul de maatkolf aan het afstuderen lijn met aceton. De meeste oplossingen die in gekoelde omstandigheden zal handhaven activiteit met geen merkbare vermindering van de werkzaamheid voor ongeveer een maand. 2.2.2 Wijziging van Adult Vial Test voor systemische insecticiden Vergiftiging van insecten met systemische insecticiden is duidelijk anders dan die van contact-producten. Systemische producten meestal moeten worden ingenomen door de insecten om actief te worden in plaats van de insecten die rechtstreeks exposure aan het product zoals bij contact met insecticiden. Daarom werd de volwassen flacon-test gewijzigd, zodat voor systemische insecticiden te testen. Het gewicht van de AI die nodig is voor de stockoplossing wordt berekend vergelijkbaar met die genoemd in paragraaf 2.2. De methodiek is vergelijkbaar, behalve de AI wordt opgelost in een 10% van het gewicht honing: water oplossing. Deze oplossing dient te geschieden binnen 24 uur na aanvang van de bioassay. Als de technische kwaliteit materiaal is niet in water oplosbaar is, kan een hoge concentratie van insecticide-oplossing worden gemaakt met aceton, dat slechts een kleine hoeveelheid van het insecticide: aceton-mengsel wordt toegevoegd aan de honing: water oplossing 4. 2.3 Het bepalen van een reeks van concentraties en ontwikkelingslanden concentraties Het bepalen van de juiste concentraties die nodig zijn om de reeks van antwoorden voor de bioassay te stellen kan moeilijk zijn. Verschillende replicaties kunnen nodig zijn om het bereik van de concentraties te definiëren en dit wordt gedaan door trial and error. Bovendien is het mogelijk het bereik te veranderen na verloop van tijd als de bevolking verandert niveaus van gevoeligheid. Tal van andere factoren moeten worden overwogen bij het vaststellen van uiteindelijke concentraties en omvatten: familie van insecten, klasse van insecticiden, de grootte van insecten, etc. Eerder gepubliceerde resultaten van de volwassen flacon tests kunnen helpen bij de eerste selectie van insecticide concentraties. Bioassays zijn gepubliceerd voor: Hemiptera: Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, Pentatomidae 8-10 en 11-14 Miridae; Thysanaptera: Thripidae 15; Coleoptera: Brentidae 16, Curculionidae 17, Coccinellidae 18-19 en Cybocephalidae 19; Diptera: Culicidae 20; Lepidoptera: Noctuidae Tortricidae 21 en 3, 22-26; Hymenoptera: Braconidae 7,18, Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, Encyrtidae 7 en Aphelinidae 18. Concentraties zijn gemaakt op basis van "X" ug / ml oplossing. Echter, wanneer flacons worden voorbereid voor de volwassen flacon test, zal slechts 0,5 ml worden toegevoegd aan elk flesje, dus de concentratie van de flacon is de helft van de concentratie gemaakt. Zodra concentraties worden gekozen, de volgende vergelijking kan helpen bij het bepalen van de hoeveelheid oplossing toegevoegd om de gewenste concentratie te maken. (C1) (V1) = (C2) (V2) Waar C1 is de concentratie van de stockoplossing, V1 is het volume van de voorraad die nodig is om de nieuwe concentratie te maken; C2 is de concentratie wordt voorbereid, en V2 is het volume van de nieuwe concentratie. Bijvoorbeeld, is 5mls van een 100μg/ml voorraad oplossing die nodig is om een ​​100mls van een 5μg/ml te maken. Dit 5μg/ml oplossing zou resulteren in flacons gecoat bij een concentratie van 2.5μg/vial. 5mls = [(5μg/ml) (100mls)] / (100μg/ml) 2.3.1 Adult Vial test voor Contact insecticiden Gedeeltelijk te vullen volumetrische flaks, en aliquot de berekende hoeveelheid stamoplossing nodig is om de gewenste concentratie te maken. Vul de maatkolf met aceton om het afstuderen lijn en ga verder met paragraaf 2.4 of te verzegelen met Parafilm M (Alcan Inc, Neenah, WI) voor het bewaren in de koelkast voor later gebruik. De meeste oplossingen zijn goed voor 1 maand. 2.3.2 Wijziging van Adult Vial Test voor systemische insecticiden Dit proces is hetzelfde als eerder vermeld in 2.3.1, behalve een 10% van het gewicht honing: water oplossing wordt vervangen door aceton. Mix genoeg honing: water oplossing om alle gewenste concentratie te maken. Deze oplossingen moeten worden gebruikt binnen 24 uur na bereiding. 2.4 Voorbereiding van de injectieflacons 2.4.1 Adult Vial test voor Contact insecticiden Als de concentraties waren opgeslagen in de koelkast, laat opwarmen tot de omgevingstemperatuur. Het volume van aceton verandert op basis van de temperatuur waarop de insecticide concentratie kunnen beïnvloeden. Kleur code 20 ml glazen flacons (geschikt voor schroefdoppen) voor de concentratie met behulp van verf of stiften. Stel een herhalend pipet om 0.5ml/concentration te leveren. Beginnen te werken met aceton controle, na met de laagste concentratie en verder te gaan met toenemende concentraties tot alle concentraties zijn gebruikt. Giet ongeveer de helft van het volume van de oplossing als het werkelijke aantal flacons dat moet worden behandeld (dat wil zeggen, 20mls voor 40 flesjes) in een klein bekerglas. Als de oplossing niet in gebruik is, dek het af om verdamping die kan leiden tot veranderingen in de concentratie te minimaliseren. Teken het insecticide oplossing in de zich herhalende pipet en breng 0,5 ml oplossing in individuele glazen flesjes. Onmiddellijk na de behandeling worden de glazen flacons geplaatst op een commerciële hot dog roller. Als de rollen draaien, glazen flesjes draaien en het aceton verdampt, waardoor de binnenkant van de flacon bekleed met de technische kwaliteit insecticide. Warmte kan degrade insecticide, daarom is het belangrijk dat de warmte wordt uitgeschakeld. Dit kan gedaan worden door het loskoppelen van de verwarmings-element op een model dat verwarmt en rollen gelijktijdig en wordt gecontroleerd door dezelfde schakelaar of met behulp van een model van hot dog roller die onafhankelijk van elkaar functioneren heeft schakelaars voor het verwarmingselement en rollen. Voorkomen dat het behandelen van meer flesjes dan de rol houdt; de aceton kan verdampen voordat de glazen flesjes worden gedraaid en zij kunnen een gelijkmatige laag niet te ontvangen op de flacon muren. Laat de flesjes te draaien totdat alle aceton is verdampt. Er misschien een dun laagje aceton-condensatie op de flacon muren, daarom flesjes moeten individueel worden onderzocht. Tijd die nodig is om flesjes varieert op basis van laboratorium-omstandigheden rollen. Zodra de flacons zijn droog, cap en op te slaan ze in gekoelde of donkere omstandigheden. Insecten zijn waargenomen rustend op deksels met conische liners of gescheurde folie liners die hangen onder de lip van de flacon (dat wil zeggen, het vermijden van behandelde oppervlakken), daarom is het belangrijk om niet-bekleed deksels. Eventuele resterende oplossing niet gebruikt om de flesjes te bereiden moet goed worden afgevoerd. De oplossing die nog in de maatkolf kan worden afgesloten met Parafilm en opgeslagen in de koelkast. Datum van de flacons wanneer zij bereid zijn, omdat verschillende insecticiden hebben verschillende houdbaarheid. Bijvoorbeeld, pyrethroid-gecoate flacons zijn goed voor ongeveer een maand, en dat flacons bedekt met een meer onstabiele insecticide, als een organofosfaat, hebben houdbaarheid van twee weken of minder. 2.4.2 Gewijzigde Adult Vial test voor systemische insecticiden Steekschuim is nodig om te dienen als een substraat voor het leveren van de insecticide-oplossing om insecten 4. Gesneden steekschuim (12mm x 12mm) stukken met behulp van een kurkboor. Leg een stuk steekschuim in de glazen flesjes eerder beschreven. Vul het herhalen pipet aangepast aan 0,5 ml oplossing te leveren en op het steekschuim afzien. Dit volume van de vloeistof moet verzadigen het stuk steekschuim, maar mag niet hoger zijn dan het niveau van het schuim in de flacon. Weer aan het werk in volgorde van de controlegroep (10% van het gewicht honing: water oplossing alleen) en de laagste tot de hoogste concentraties. 2.5. Het opslaan van Vials 2.5.1 Adult Vial test voor Contact insecticiden Bij het opslaan van insecticide gecoat flacons, kennen de eigenschappen van het insecticide. Verschillende insecticiden hebben verschillende storage eisen, zoals: pyrethroïden zijn lichtgevoelig en kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur, maar in het donker, maar organofosfaatinsecticiden zijn temperatuur gevoelig en moeten worden opgeslagen in een vriezer. Indien insecticiden moeten worden opgeslagen in de vriezer, moeten ze worden opgewarmd tot kamertemperatuur voordat het blootstellen van de insecten. 2.6 Bioassay Verzamel de insecten te testen. Dit proces kan worden gedaan met behulp van feromoon-aas vallen, vegen netten, of enig ander middel van massa vast te leggen. Insecten moeten worden gehouden voor 8-24u te zorgen voor natuurlijke sterfte te komen voor degenen die gewond tijdens het incassotraject, hen voorzien van voedsel en vocht een bron in deze periode. Test 10-25 insecten per concentratie (10 minimum), hoe groter het aantal geteste insecten, de robuustere de data set zal zijn. Bij het selecteren van insecten voor de biologische, kiezen voor een gezonde, actieve mensen en gooi deze weg lethargisch of abnormale individuen. Plaats insecten in de injectieflacons zodanig dat zij worden blootgesteld aan het volledige scala van de concentraties en niet slechts een concentratie op een moment. Deze procedure wordt voorkomen dat het plaatsen van de meest gezonde en actieve individuen in een of enkele concentraties. Bovendien, als het niet mogelijk is uit te voeren het experiment met een minimum van 10 insecten per concentratie, ontmaskeren zo veel mogelijk aan elke concentratie. Dan verzamelen meer insecten uit hetzelfde monster gebied binnen een korte tijd (twee-drie weken) en herhaal het experiment. Sommige insecten kunnen verliezen gevoeligheid (build weerstand) als het gewas seizoen vordert, dus de reactie van mensen verzameld in het vroege voorjaar kunnen verschillen van zij die in het najaar 28. Ontwikkelen van criteria om sterfte te beoordelen. De meest gebruikte criteria die worden gebruikt om insecten als stervend of dood te classificeren zijn een gebrek aan gecoördineerde bewegingen. Deze observaties kunnen de onmogelijkheid om recht zelf als op de rugzijde, niet in staat om gecoördineerde vlucht van 1m of gebrek aan coördinatie in beweging wanneer zachtjes geprikt met een stomp voorwerp te houden. Als het individu kan recht zelf, maar valt over, er is geen gecoördineerde beweging, het insect moet worden overwogen dood. Het insect kan moeilijkheden ondervinden rechtzetten zich op een gladde ondergrond, dus, het misschien nodig is om het insect leveren een oppervlak zodat zij in staat is om de tractie nodig is om recht zelf te krijgen. Noteer het nummer van deoverlevenden en dode individuen om de overlevingskans te berekenen voor elke concentratie. 2.6.1 Adult Vial test voor Contact insecticiden Plaats het insect (s) in de flacon en losjes zet de dop. Het deksel moet het insect te verhinderen te ontsnappen, maar los genoeg om de luchtstroom te laten worden. Voor de meeste insecten bioassays, is slechts een insect geplaatst in elke flacon, maar kleine insecten, zoals witte vlieg of trips, kunnen worden blootgesteld met een snelheid van maar liefst 30 personen per flacon 6, 15. Rechtop plaats de flacons bij kamertemperatuur totdat de insecten worden beoordeeld voor de sterfte op het eindpunt van de bioassay. Belichtingstijden kan verschillen met de soort en eventueel de insecticide 3,5-27. In het proces van vaststelling van de initiële toxiciteit niveaus met een nieuw insect of chemische, toezicht op de onderwerpen op meerdere geplande tijdstippen na de blootstelling. Examens kunnen worden beëindigd wanneer de sterfte op de hoogste concentratie is 100% met behoud van een hoge overleving (<10% sterfte) in de niet-insecticide behandelde controle. Als 100% sterfte is niet gehaald bij de hoogste concentratie met een hoge overleving in de controle, moet de bioassay worden herhaald met een reeks van hogere concentraties. Idealiter zou de sterfte te verhogen als de insecticide concentratie toeneemt. Sommige insecten, wanneer zij worden blootgesteld gedurende 24 uur, vereisen een bron van vocht (dat wil zeggen, een klein stukje van plantaardig materiaal) 12. Bij het werken met een delicate insect, is het nuttig om te bepalen hoe lang het insect kan in de flacon overleven zonder een bron van vocht voorafgaand aan de insecticide blootstelling in de volwassen flacon test. Deze informatie kan worden vastgesteld door het plaatsen van het insect in een flacon met en zonder een vocht bron en de controle op de overlevingskansen na verloop van tijd voor het uitvoeren van de eigenlijke insecticide enquêtes. 2.6.2 Gewijzigde Adult Vial test voor systemische insecticiden Voorafgaand aan de opening van het bioassay, bepalen of het insect kan voeden en overleven op steekschuim verzadigd met de honing: water oplossing in de afwezigheid van insecticide. Plaats insecten in injectieflacons met steekschuim verzadigd met honing: water (of honing: water met het grootste volume van aceton wordt gebruikt bij de voorbereiding van concentraties met niet-water-oplosbare technische kwaliteit insecticide) en monitor overleving voor meerdere dagen. Deze wijziging van de volwassen flacon test is alleen onderzocht met een Miridae 4 en een Pentatomidae 29, dus, het bepalen van de duur van de test is meer experimenteren dan voor het contact insecticide bioassay. Zo werd Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) bij de beoordeling voor de sterfte op 24 uur na blootstelling aan thiamethoxam, maar 72 uur voor imidacloprid 4. Mortaliteit van Oebalus pugax F. werd beoordeeld na 96 uur bij blootstelling aan dinotefuran 29. Daarom moet insecten overleving in de controle flacons constant hoog worden gedurende verscheidene dagen voordat een accurate sterfte rating van insecticide intoxicatie kan worden gemaakt. Plaats het insect (s) in de scintillatieflesje met de verzadigde steekschuim. In plaats van het afsluiten van de flacons met deksels, seal flacons met een katoenen bal. Rechtop plaats de flacons bij kamertemperatuur totdat de insecten zijn beoordeeld op sterfte. Zoals eerder vermeld, snelheid sterfte op regelmatige tijdstippen. Onderzoek kan worden beëindigd als er 100% sterfte bij de hoogste concentratie met een hoge overleving (<10% sterfte) in de controlegroep. Het kan nodig zijn om extra concentraties te testen. 2.6.3 Data-analyse De juiste voor de sterfte in de controlegroep behandeling met behulp van een formule volgens Abbott 30. Gecorrigeerde sterfte (%) = ((% overleving control -% overleving behandeld) /% overleving controle) x 100 Analyseren van gegevens met behulp van in de dosis probit voor de dodelijke concentratie vereist is om 50% van een bevolking (LC 50) te doden en 95% betrouwbaarheidsintervallen (CL) tot stand te bepalen. Meerdere softwareprogramma's beschikbaar zijn voor de LC 50 (SAS: PROC Probit 31, Polo-Plus 32) te bepalen. 3. Opmerkingen Werken met aceton en insecticiden onder een negatieve air-flow kap. Bij het vullen van maatkolven, is het het beste om twee wassen flessen aceton. Een wasbeurt fles die is aangepast voor de snelle levering van vloeistoffen en een voor de trage levering. Verwijder een deel van de levering arm om een ​​grotere opening te creëren en deze fles kan worden gebruikt voor de levering van een groot volume snel. Zodra de aceton nadert tot het afstuderen lijn, verander flessen en gebruik de wasfles met langzamere levering, zodat u meer controle over het bedrag dat wordt verdeeld. Als een fles gevuld is boven het afstudeerproject lijn, laat de bovenkant uit en laat aceton verdampen het afstuderen lijn. Let op de hoeveelheid neeDED van de stockoplossing, die nodig is om een ​​concentratie, dat wil zeggen voor te bereiden, als je vult de fles ¾ de weg, maar noodzaak om toe te voegen 30mls, kan je over het afstuderen lijn.