Метод мышей Изоляция Островок и субкапсулярной трансплантации почек

1. Подготовка и калибровка Liberase реагент Этот протокол использует Liberase TL (Roche, Cat # 05 401 020 001) ферментов поджелудочной пищеварения. Покупка 100-200мг в то время, и сделать большую партию. Повторное приостановить лиофилизированного порошка в стерильной воде класса ВЭЖХ, так что концентрация составляет примерно 26 Вунш единиц на мл. Это должно быть около 5 мг / мл. Смотрите вкладыше подробную информацию о единицах Вунш, содержащихся в конкретной партии. Место флаконов на льду в течение 30 минут с языческими закрученного каждые несколько минут. Убедитесь в том, порошок полностью не растворится в конце 30 минут. Бассейн всех растворенных Liberase вместе и смешать с нежным закрученного (НЕ вихрь или трясти). Алиготе 24,3 Вунш единиц предварительно охлажденное Eppendorph трубы, быстро замораживание жидким азотом (рассматривать его как любой ферментов) и хранят при температуре -80 ° C. Это должно быть примерно 0.935ml на пробирку Eppendorph. Каждый аликвоту для одноразового использования (достаточно для 11 мышей) и не должны быть сохранены или повторно замороженного После оттаивания. В общем, запас стабилен в течение не менее 6 месяцев. Для каждой новой партии, калибровки оптимальное время инкубации. Использование замороженных акции, а не только что растворенный акций, для калибровки, для имитации реальных экспериментальных условиях, насколько это возможно. Калибровка водяной бане, которые вы собираетесь использовать, чтобы точно 37 ° С с использованием ртутного термометра. Используйте те же инкубатор в будущих экспериментах. Перед использованием оттепели трубки Liberase на льду и добавить его (0.935ml), чтобы 21.6ml бессывороточной RPMI, делая окончательный рабочий концентрации 1,08 Вунш единиц на мл. Сыворотка, BAS и ЭДТА подавляет Liberase. Цинк и кальций кофакторов. Магазин на льду и использовать в течение 1,5 часов. Этого достаточно для примерно 11 мышей (2ml/mouse). См. шаг 2.3 для поджелудочной железы перфузии. Заливать столько мышей насколько это возможно в 1 час. Затем с помощью одного или двух мышей для каждого времени инкубации и тестирования 10, 12, 14, 16, 18 минуты время инкубации. Если это возможно, в том числе 30 секундными интервалами между делом, как сроки пищеварения очень важно. Полное островок протокол изоляции и анализировать островок урожайность и качество от каждой точки времени инкубации. В конце концов выход не должны меняться слишком много между часы пик, но качество островков на эти интервалы могут быть различными. Для последующих экспериментов, использовать условия, которые приводят к наибольшим числом островков, которые являются здоровыми через 48 часов после изоляции. Возраст мышей появляется, чтобы повлиять на оптимальное время инкубации. Таким образом, использовать мышей в аналогичной возрастной диапазон. В идеале, используйте 8-12 недельных мышах, однако, даже 8-10 месяцев старых мышей может дать хороший островков. Для целей калибровки, используйте молодых мышей. 2. Хирургические процедуры Подготовьте все оборудование и средства массовой информации, прежде чем эвтаназии островок мышей-доноров. Автоклав или пламя стерилизовать инструменты перед использованием. Все реагенты и приборы (прикосновения образцов) должна быть стерильной. Изоляции и ручной сбор островки могут быть выполнены за пределами ламинарном боксе без существенного увеличения заболеваемости загрязнения. Тем не менее, стерилизации инструментов, которые вступают в контакт с островков поджелудочной железы или имеет решающее значение для предотвращения загрязнения. Следующие инструменты необходимы: 1 пара рассекает ножницы для разреза брюшной полости. 2 пары щипцов. 1 гемостатический пинцет для зажима от желчных протоков. 0,419 мм в диаметре проволочной сетки. Диаметром 0,1 мм нейлоновой сетки. Бенд несколько 27 иглы, так что 70 градусов вводится примерно на полпути вниз по всей длине иглы. Скошенный край игла должна быть обращена внутрь локтя. Заполните распылитель с 70% этанола. Настройка рассекает микроскоп с адекватным источником света на лабораторном столе или в капот. Предварительное охлаждение центрифуги до 4 ° C. Центрифуга должна иметь ротора качели ведро, быть способным 900xG, хранить в холодильнике, и перерыв, который может быть отключен. На Sorvall RT6000D с Sorvall H1000B ротора, 900xG скорость 2400RPM. Медленнее спины сделано на 800RPM. Место следующие реагенты на льду. RPMI (1 литр с 10% сыворотки) RPMI (200 мл без сыворотки) 50 мл конические пробирки (1 для каждого поджелудочной железы) 5 мл шприца. Равновесия Histopaque1077 до комнатной темпераспределителем. Оттепель одного аликвоту использование калиброванного Liberase на лед и разбавить в 22.5ml бессывороточной RPMI. Сыворотка, BAS и ЭДТА подавляет Liberase. Цинк и кальций кофакторов. Магазин на льду и использовать в течение 1,5 часов. Этого достаточно для примерно 11 мышей (2ml/mouse). Теплая 37 ° С водяной бане. Иметь под рукой столько мышей, как вы можете вводить иглу через 1 час (примерно 10 – 18 мышей). Подготовка мышь для катетеризации. Первый эвтаназии мыши цервикальным сдвигом или CO 2 удушья. Хотя мышь заканчивается, заполнение 5 мл шприц с 2 мл Liberase рабочий запас (1,08 Вунш ед / мл). Наведите в лежачем положении на бумажном полотенце на вскрытии масштаб и спрей живота с 70% этанола, прежде чем открыть ее живота с V-разрез от лобковой области для обеих передних ног. Сложите кожа над грудью раскрыть брюшную полость. Поместите мышь с головы по направлению к вам. Найдите двенадцатиперстной вступления общего желчного протока, как было подчеркнуто на рис.1. Это может быть сделано, не глядя через рассекает сферу цели. Зажим двенадцатиперстной открытия с кровоостанавливающего, как показано на рис.2. Зажим положение имеет решающее значение для блокирования потока Liberase в кишечник. Если зажим слишком высокая или слишком низкая, Liberase не будет заливать поджелудочной железы. Позиция кровоостанавливающего, таким образом, чтобы при сжатии, он работает точно по поджелудочной железы / кишечника границы. Перед cannulating общего желчного протока, может быть необходимо, чтобы изменить печени путем нажатия на нее против диафрагмы, так что по всей длине общего желчного протока подвергается (рис.3). Как только длина желчных протоков подвергаются, используя изогнутые 27-gague игла прилагается к Liberase заполненный шприц для катетеризации. Есть два способа cannulating желчных протоков. В первом способе, или метод «свободной руки», кровоостанавливающего, закрепленной на двенадцатиперстной кишки является оторвался от главы мыши к хвосту, так что общий желчный проток становится подтянутой. Существует слияния в желчных протоках близка к печени, где желчь дренаж из желчного пузыря и ферменты из печени собрались перед входом в кишечнике. Внутри V, образованный этой слияние подвергается, потянув желчных протоков плотно и является идеальным местом для начала катетеризации протока (рис.4). Если в правильном положении, игла будет скользить прямо через V, так и непосредственно вводить иглу нижней части канала. Вставьте иглу несколько миллиметров в канал до выдачи Liberase. Оптимальное расположение иглы очень важно для предотвращения обратного потока в печени и желчном пузыре. Кроме того, важно, чтобы игла не быть вставлен так далеко, что препятствует селезенки протока. Селезенки проток трудно понять, филиал общего желчного протока и это истощает селезенки хвоста поджелудочной железы, островок богатой области. Если игла слайды прошлых отверстие для селезенки проток, там будет меньше, чем полная перфузии селезенки хвост и, возможно, снижается усвоение этой области. Оптимальный выход островке происходит, когда ваша игла глубина достаточно далеко, что не Liberase уходит на печень / желчный пузырь, но не так далеко, что вы прошли селезенки протока. Вы можете проверить, для успешной катетеризации путем дозирования Небольшое количество Liberase. Если вы видите Liberase заполнения канала, то обойтись без остального 2mls. Если область вокруг канала начинает заполняться, остановка выдачи, переместить иглу, и повторите попытку. Во второй метод, или метод «щипцы помочь, кровоостанавливающего, закрепленной на двенадцатиперстной кишки является оторвался от главы мыши к хвосту, так что общий желчный проток становится подтянутой. Затем, используя изогнутые 27-gague игла прилагается к 5 мл шприц, проколоть фасции ниже общего желчного протока близка к печени. Используйте иглу, чтобы очистить от фасции канала (рис. 5). С иглой-прежнему на месте, установить кровоостанавливающего вниз и забрать пару щипцов. Используйте одну руку открытой щипцы, чтобы поднять желчных протоков, где игла расчистил фасции. Хребтов щипцы создать тракта, которые можно использовать для руководства иглу в канал. Хотя тянет проток и щипцы к вам, слайд-иглу в канал использованием щипцов в качестве обратного хода. Тест для катетеризации путем дозирования Небольшое количество Liberase. Если канал начинает заполняться (рис.5 Arrow), отпускать остальных 2mls. Если область вокруг канала начинает заполняться, остановка выдачи, переместить иглу и повторите попытку. Как 2mls из Liberase заполняет поджелудочной железы, расположенной возле двенадцатиперстной кишки начинает расширяться первым, за ним региона в верхней части желудка, и, наконец, селезенки хвост (рис.6). Ищите даже расширение поджелудочной железы (рис.6). Если одна область начинает расширяться, и вы не видите белую ткань равномерно расширяется и разводя, вполне вероятно, что общий желчный проток не канюлированные, но игла находится внутри капсулы поджелудочной железы. Заполнение капсулы с Liberase не приведет к высокой доходности, как островок площадью поверхности подвергается фермента будет низким. Если это произошло, прекратите перфузии и положение иглы. Как только поджелудочная железа была перфузии, он может быть удален из мыши, потянув его из точек соприкосновения с кишечника, желудка и селезенки. Начните с удаления кровоостанавливающего из двенадцатиперстной кишки. Затем с помощью пинцета снять двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы отдельные из кишечника с второй парой щипцов (FIG.7A-B). Это делается путем проведения второй парой щипцов устойчивый, потянув кишечника из брюшной полости. Затем потяните поджелудочной железы свободными от верхней части желудка и селезенки (FIG.7C-D). Наконец, поднимите поджелудочной железы из брюшной полости и вырезать его из оставшихся фасции соединений (FIG.7E-F). Место поджелудочной железы в 50 мл коническую трубку и оставить его на льду во время работы над другими мышами. Начало 1 час таймер. Для максимальной доходности островок, место только один поджелудочной железы в каждую пробирку. Не рекомендуется оставлять перфузии pancreata на льду в течение более 1 часа, а Liberase начнет деградировать ткани. В конце часа, сразу переходите к шагу 3.0 для всех pancreata, которые были перфузии. Повторите действия 2,3 – 2,6 для остальных мышей или пока таймер 1 час начался в шаге 2,6 истек. 3. Очищающий Островки с перфузией Pancreata Перед островки могут быть очищены от поджелудочной железы, ткань должна быть переварены при температуре 37 ° C. Группа 50 мл пробирки подшипников перфузии островки в открытой стойке нижней, которая вписывается в 37 ° С водяной бане. Убедитесь, что все крышки хорошо закреплены и погружать трубы в 37 ° С на водяной бане точное количество времени заранее определенные для текущего партии Liberase (См. шаг 1.4). В конце инкубации, перемещение труб в лед и добавить RPMI1640 с 10% сыворотки, чтобы 20mls в трубке. Сыворотка средах остановится Liberase пищеварения. Дистанцироваться ткани, встряхивая труб энергично 40 раз в 10 секунд. Этот шаг имеет решающее значение для оптимального восстановления островков. Даже при оптимальной перфузии Liberase и плотно калиброванный пищеварения время островок доходность будет низкой, если ткани не распалась. Агрессивной обработки образцов на этом этапе, кажется, не вредит мыши островков и необходимо, чтобы освободить их от экзокринной кластеров клеток. Для отдельных островков из переваривается поджелудочной железы, выполните следующие действия. Бассейн переваривается pancreata чтобы Есть примерно 2,5 pancreata в трубке. При этом десять труб будет конденсированных до 4 труб с 50 мл СМИ каждый. Пробирки центрифужные в течение 2 минут при 800RPM и 4 ° C. Слейте надосадочную и ресуспендируйте гранул в 15-25mls средств массовой информации с 10% FBS на вортексе мягко (настройки интенсивности вихря приблизительно 50% от максимального) в течение нескольких секунд. Налейте ресуспендировали суспензии через 0.419mm проволочной сетки и воронки в свежем 50 мл коническую трубку. Это выделяется не-переваривается ткани, жира и лимфы. Промыть исходной трубки с дополнительной 10mls средств массовой информации, содержащей 10% FBS и залить через проволочную сетку. Повторите этот процесс для остальных труб. Центрифуги трубы в течение 2 минут на 800RPM и 4 ° C. Слейте надосадочную жидкость и тщательно инвертировать трубок на бумажное полотенце. Наблюдать, чтобы убедиться, что островки не соскальзывают. Протрите внутреннюю часть трубы с бумажным полотенцем, чтобы удалить остатки средства массовой информации, стараясь не нарушать клеточный осадок. Вернуться труб вертикальном положении. Ресуспендируют гранул в 5mls комнатной температуры histopaque1077 на вортексе мягко в течение нескольких секунд. Убедитесь, что приостановка однородна, прежде чем добавлять дополнительные 5mls из Histopaque вокруг внутри трубки. Это моет островков от стенки трубки. Наложение Histopaque с 10mls сыворотки свободного RPMI, стараясь сохранить резкой границы между Histopaque и СМИ. Добавить средств массовой информации с помощью пипетки медленно вниз стороне трубки со скоростью 1 мл на 10 секунд. СМИ должны быть на вершине, и Histopaque на дне. Сыворотка влияет на плотность СМИ и не должны использоваться во время этого шага. Спиновые образцов в Центрифуга доведены до 20 ° C на 2400RPM (900xG) в течение 20 минут с очень медленным ускорением и не торможение. Этот шаг отделяет островки из экзокринных клеток. Островки будут мигрировать на границе сыворотки свободных СМИ и Histopaque в то время как клетки экзокринных шбуду форме гранул в нижней части трубы. Сбор островки из Histopaque / раздела сред с одноразовыми 10мл серологические пипетки. Островки будет прилипать к стеклу, поэтому стеклянные пипетки не должен использоваться, если они не силиконовая. Место островков в свежем 50 мл коническую трубку. Несколько трубы могут быть объединены в этой точке. Заполните труб 50мл с сыворотки, содержащей RPMI. Пробирки центрифужные в течение 2 минут при 800RPM и 4 ° C. Слейте надосадочную и ресуспендируйте островков в 50 мл сыворотки содержащей RPMI на вортексе мягко. Центрифуги трубы в течение 90 секунд на 800RPM и 4 ° C. Слейте надосадочную и повторить процедуру еще 1 раз. Слейте надосадочную и принять труб капот культуры ткани. Добавить ручка / стрептококк в RPMI, содержащей 10% FBS в конечной концентрации 1%, чтобы сделать островок медиа культуры. Ресуспендируют островки в 5mls этой культуры средств массовой информации. Обратить 0,1 мм сито ячейка нейлоновых и поместите его на 15 мл коническую трубку. Медленно проходит ресуспендировали шлама островок через сито. Островки будут сохранены в то время как фильтр экзокринных клетках проходят в 15 мл коническую трубку. Этот шаг значительно увеличивает чистоту островков по отношению к экзокринной загрязнения ячейки в конце протокола. Промыть 50 мл коническую трубку с дополнительным 6mls средств массовой информации и пипетки через сито. Место 3mls медиа-культуры, как большая капля в 10-см чашке Петри. Обратить правой ячейки фильтра вверх, так что поверхность используется для захвата островков можно окунуться в каплю средства массовой информации. Касаясь фильтр для средств массовой информации будет передавать большую часть островков в не-культуры тканей лечение Петри. Использование необработанных Петри имеет решающее значение для предотвращения островок адгезии и разгон до поверхности пластины. Свободно плавающий островки гораздо легче выбрали для разделения на экспериментальные группы. Внесите дополнительные 5-7mls медиа-культуры через ситечко в чашку Петри, чтобы вымыть любые остаточные островки прочь ситечко в блюдо. Проверьте островок урожайность и качество под 4x цель на инвертированный микроскоп. Вихревой блюдо в жесткой овальной будет собирать островки в центре блюда. Если островками выглядят хорошо, они могут быть либо сразу же взял для экспериментального использования или разделены поровну между 4-6 чашках Петри 10 см (на 10 мышей). Культивирование слишком много островков в то же блюдо причины островков стать некротических и деградировать. Для экспериментов, 250-300 островков в 6 см блюдо с 2-3mls средств массовой информации не появляется, чтобы подчеркнуть островков. Там будут какие-то полезной островков в 15 мл коническую трубку, которая собрана 0.1мм нейлоновые ячейка потока через сито. Эти островки могут быть восстановлены следующие 3:57 раундов тяжести седиментации. Примерно через 4 минуты седиментации, аспирация все, но примерно 1 мл СМИ из трубки и пополнить его на вершину с культурой массовой информации. Крышка трубки и инвертировать перемешать. Повторив эту процедуру несколько раз снимает многие из одной клетки экзокринных клеток, которые не спешат осадка, и обогащает тяжелые агрегаты эндокринных клеток (островки), которые быстро тонуть. После окончательного стремление, ресуспендируют в 7mls медиа-культуры и пластины в свежем чашке Петри. 4. Работа с изолированные островки Процесс изоляции довольно напряженный на островки; Histopaque токсичен, встряхивания и центрифугирования шаги вызывают явный стресс, и удаление из крови хозяина питания, а также в культуре пробирке может вызвать гипоксию. Мы и другие показали, что изоляция вызывает бета-клеточной гибели 4-5. Эффект от этих напряжений рассматривается отторжения клеток от периферии островков и потемнение и изгнание центральное ядро ​​островок (центральный некроз). Хотя отторжения клеток от периферии может быть терпимо, центральный некроз островок дисквалифицирует его для использования в экспериментах. Как правило, чем больше островок, тем больше вероятность того, что центральным некрозом будут проблемы. Усилия, направленные на снижение сообщение островок в изоляции стрессовую реакцию увеличит выход полезной островков. Поэтому мы используем сообщалось ранее технику инкубации островки в 22-27 ° C культуре ткани инкубатор для первых 48-72 часов после изоляции 6-8. Это привело к снижению температуры гасит ответ островков стресс и разглаживает их перехода к культуре в пробирке. Если 22-27 ° C культуре ткани инкубатор не доступна, можно достичь желаемой температуры в диапазоне стандартных тканевых культур инкубатор, отключив тепло контроль и размещение около 20 фунтов вморозильник кирпича доведены до -80 ° C. Это приводит к приблизительно 16-24 часов по пониженной температуры в инкубаторе. Замените -80 ° C морозильник кирпича по мере необходимости. Мы не наблюдали дополнительную выгоду от инкубации при этом более низкую температуру дольше, чем 72 часа. В дополнение к низкой температуры инкубации, мы рекомендуем изменить средств массовой информации через 24-48 часов после изоляции. Выделяется из факторов стресса и мертвые островки накапливаться в СМИ после изоляции и может способствовать дополнительному стрессу островок. Для изменения информации, выполните следующие действия. Передача средств массовой информации и островков из чашки Петри с 15 мл коническую трубку с помощью пластикового пипетки. Промыть пластины с дополнительной 3mls питательных сред для сбора остаточных островков. Добавить эту дополнительную 3mls в 15 мл коническую трубку и позволяют островки свободного падения осадков за 5 мин. Аспирируйте все, кроме 1мл средств массовой информации из 15 мл коническую трубку, затем ресуспендируют островки в 4mls СМИ островок культуры. Передача островков и СМИ, чтобы свежая пластинка Петри. Добавить дополнительные 3mls медиа-культуры в 15 мл коническую пробирку для сбора остаточных островков и добавьте в чашку Петри. Изменение островок СМИ каждые три-пять дней после этого. При выборе островки для эксперимента, не рекомендуется смешивать островки из разных выделений. Молекулярной базовой островков зависит от многих вещей, в том числе количество времени они были в сфере культуры и стресса изоляции, которая варьируется от приготовительные к преп. Чтобы уменьшить изменчивость, островке эксперименты должны быть выполнены на островки, которые были изолированы в то же время. Однако, если это не представляется возможным, мы настоятельно рекомендуем объединения всех островков в одну группу до выбора их для экспериментов. Чтобы подобрать островки для экспериментов, выполните следующие действия. Если островки вынашиваются в более чем одном блюде, бассейн все островки в единое блюдо, выполнив следующие действия 4.3.1 через 4.3.5, перечисленных выше. Если несколько блюд из островков вовлечены, 50мл коническая трубка должна быть использована вместо 15 мл трубки. Это может уменьшить изменчивость индуцированных тонкие различия в культуре условий между пластинами в период после изоляции восстановительного периода. Во тяжести осадок островков, созданная инвертированный микроскоп оснащен 4x или 10x цели. Сбор микропипетки P200 и коробка стерильных P200 советы. Передача осевших островков на одной пластине и перемещать пластину микроскопа. Swirl пластина для сбора островков в центре. Снимите крышку к пластине и использовать P200 пипеткой, чтобы выбрать здоровый островков. Здоровый островки имеют гладкие границы и никаких темных областей центре (рис. 8). Старайтесь поддерживать равномерное распределение по всему островку размеров экспериментальных блюд, как островок размером может изменить реакцию на лечение. Число островков в экспериментальной группе может меняться в зависимости от потребностей эксперимента. По нашим оценкам, один островок имеет приблизительно 1000-2000 клетки и даст 0,3-1 мкг белка и 25ng от общего числа РНК. Ибо в пробирке анализы, типичной экспериментальной группы может быть от 100 до 250 островков покрытием в 35-мм или 6 см блюда с 1-3 мл СМИ. Для пересадки, каждый получатель мыши потребует от 150 до 400 островков в зависимости от экспериментального проектирования (см. шаг 5.2.2 и обсуждение подробнее). Чтобы свести к минимуму изменения введены стороны процесса выбора, мы используем отверстие P200-пипетки в качестве ориентира для оценки островок размером. Большинство островков имеют диаметр примерно половина диаметром сопла, и мы рассчитываем каждый из них в качестве одного стандартного островок. Любой островков больше или меньше, чем мы присваиваем разном островок соответственно. Мы собираем островков в партиях от 20-50 и передавать их в назначенный экспериментальные блюда. Если Р200-пипеткой установлен в объеме 180 мкл, можно собрать несколько островков (как правило, более 50 островков) в один наконечник. Таким образом, хотя островки собирают по одному за раз, можно собрать много островков в каждом P200-наконечник, контролируя механизм pipetman релизе. Это облегчает выбор из сотен или даже больше, чем тысячи островков необходимых для экспериментов. Мы также используем эту партию стрелке операцию, чтобы помочь выровнять распределение островков с аналогичного качества и размера. 5. Субкапсулярной почек Островок трансплантации Вызвать сахарный диабет у мышей трансплантации реципиенту. Место мышей от 4 до 6 часов быстрее. Оптимальное реципиентов должна быть в пределах от 6 до 10 недель и весом от 20 до 25 граммов во время поста. Для перемотки мышей, удалите пищу из feediнг стойку и всегда ставим мышей в свежем клетке. Это гарантирует, Истинный пост, разделяя мышей от любой остаточной кусочки пищи, что, возможно, ранее попавших в их клетке. План на 80% до 90% мышей, чтобы стать сахарный диабет. Три часа в быстрой, подготовить буфера цитрата натрия. Отвешивать 0.735g ферментов класса цитрат натрия (Na цитрат, г-н 294,10 г / моль) и растворить его в 25mls стерильной деионизированной водой. Скорректировать значение рН до 4,5 использованием соляной кислоты. Этот буфер должен быть свежими для каждого круга экспериментов. Место 0,05 г стрептозотоцина (СТЗ, М т 265,2 г / моль) в 1,5 мл трубки Eppendorph. Эта сумма является достаточной, чтобы вызвать диабет у примерно 8 мышей. Подготовка достаточного количества 1,5 мл трубы для числа мышей для инъекций. СТЗ является светочувствительным, поэтому покрытие каждую пробирку с алюминиевой фольгой. Через 4 часа быстрой, ресуспендируют одна трубка СТЗ с 1 мл свежеприготовленного Na цитрат буфера. После ресуспендировали, СТЗ-Na цитрат решение теряет активность в течение 15 до 20 минут, так что этот шаг следует делать только непосредственно перед инъекционных мышей. Inject каждой мыши внутрибрюшинно соответствующий объем СТЗ-Na цитрат решением для достижения окончательной дозы 190mg/kg мыши. Эта доза может варьироваться в зависимости от штамма и возраста мыши, поэтому это может быть необходимо для выполнения оптимизации дозы, если заболеваемости диабетом слишком низкая или, если слишком много мышей умирают в 3 до 5 дней после инъекции. Общие дозы, используемые в диапазоне от 150mg/kg мыши 250mg/kg мыши. Поставки продовольствия и воды, как только все мыши были введены. Испытание для мышей без ограничений по режиму гипергликемии (> 350mg/kg) 2 до 4 дней после инъекции. Мыши, которые демонстрируют 3 дней подряд без ограничений по режиму гипергликемия может быть использован в качестве реципиентов. Подготовка островков для трансплантации Изолировать островков, как описано выше с шагом 2.0 до 4.0. При необходимости, островки могут быть выделены в день трансплантации или раньше. Выберите островков в группы для трансплантации, поместив их в стерильные 1,5 мл труб Eppendorph. Хранить трубы на льду. Число островков, необходимых для восстановления нормогликемии может варьироваться с учетом условий эксперимента (островок доноров напряжения, вес и напряжение получателя, а также любые дополнительные процедуры уделено получателя) и человека, который набирает островков. Размер получателя мышь является одним из серьезных переменная, которая влияет минимальное количество островок, а больше мышей потребует больше островков. Мы неизменно показывают, что от 150 до 250 островков лишь незначительно восстанавливает нормогликемии в то время как 300 островков или более в лечебные 18 до 20gram C57BL / 6 получателя мыши. В этих экспериментах островок мышей доноров были либо C57BL / 6 или Balb / c. Пересадка островков в субкапсулярной мешочек почек Соберите следующие материалы (все хирургические инструменты должны стерилизоваться): Таблица 1. Оборудование для трансплантации 25 мкл Hamilton Шприц 6 "из ПЭ 50 гибкий шланг разрезан таким образом одна сторона скошенными Гель погрузке и P200 наконечники Стерильные Eppendorph труб (1 на одного получателя) Изофлюрана и изофлюрана испаритель Eppendorph трубки стойку Макферсон-Vannas ножницы (1) Бент щипцы руки (2) Hemostats (1) Рана клип с клипами 27 иглы Пламя вытащил стеклянный капилляр зондов трубки * Хлопок наконечником аппликаторы 50 мл коническую трубку стерильной PBS Швы Электрические ножницы 70% этанола бутылку спрей Шариковая ручка Бетадин прозрачный пластиковый стерильный драпировать * Примечание: При подготовке этих зондов, попытка создать дугу в зонд, который имитирует угол мыши почек. Кроме того, убедитесь, что конец зонда адекватно пылали полированной, так что без острых краев существуют. Взвесьте все теги и диабетических мышей получателя. Назначьте каждой мыши опытной группы до трансплантации, так что у каждой группы есть так же соответствие массы тела. Настройка операционного поля в открытом капоте передней оснащен газа на выходе из изофлюрана испарителем. Обезболить получателя мышь с изофлуран а затем побрить его фланге с электрическими ножницами. Бритье мыши за пределы области, где трансплантация будет выполнена. Вернуться мыши на анестезию и положение его лежать перпендикулярно и непосредственно над валом стеклянной палочкой так, что бритая фланге вверх. Спрей фланга с 70% этанола. Мышь должна быть нацелен с хирургической скраб переменного бетадин и алкоголь три раза. Пелерина мыши с четкими стерильной драпировки предоставляя доступ к бритой фланге. Подготовка островков для трансплантации в то время как мыши в настоящее время анестезии. Для этого выполните следующие шаги. Место стерильный наконечник загрузки гель в отверстие 1,5 мл трубки Eppendorph так, чтобы было нежное, что делает изгиб форме U в узком конце наконечника. Открытие наконечника должна быть направлена ​​прямо вверх из трубы Eppendorph. Не вводите излом в любой точке на кончике загрузке геля, поскольку это приведет к стрижка островков и сокращение количества островков, которые пересаживают. Аккуратно снимите со льда трубка островков, который был подготовлен в шаге 5.2.2. Все островки должны быть урегулированы в нижней части трубы. Используя пипетку P200, аккуратно собирать островки в минимальном объеме из нижней части трубы. Передача этих островков через большое отверстие кончика гель загрузки подготовленных на этапе 5.3.6.1. Островки должны располагаться в узкую длину или узкие ограничения наконечник загрузке геля. После островков у осажденных, удалить как можно больше средств массовой информации от кончика гель загрузкой насколько это возможно. Это может быть выполнено с помощью свежих наконечник загрузки гель придает P200 пипетируйте аспирационных СМИ через большое открытие островок несущих наконечник загрузке геля. Передача осевших островков в PE 50 гибкий шланг (~ 15 см в длину). Это может быть сделано путем присоединения первых, не скошенный конец трубки в узкое отверстие островок несущих гель загрузкой наконечник перед установкой наконечника пипетки P200. Островки могут быть протолкнул 60% от длины трубы. Передача островок подшипника PE 50 трубки на шприц 25 мкл Hamilton. Убедитесь, что поршень шприца была снята перед передачей трубки. Подключение не-скошенным краем ПЭ трубы до 50 иглы шприца. Нажмите на поршень шприца до островков около 0,5 см от скошенной открытия. Установите шприц в сторону так, что островки могут обосноваться в единую массу около скошенными открытия трубки в то время как почки готовится получить островки. С помощью пальцев, локализовать почки через кожу мыши под анестезией. Вал шариковой ручки должны быть непосредственно под областью, где почка находится и расположены перпендикулярно к спинному мозгу. Как только почки локализован, используйте Макферсон-Vannas ножницы, чтобы сделать 2 см разрез через дерму прямо над его в направлении, перпендикулярном к спинному мозгу. Этот разрез выставят брюшную стенку. С Макферсон-Vannas ножницами сделать 1 см разрез через брюшную стену в том же направлении, прорезают кожного слоя. Важно, что открытие созданного этот разрез быть меньше, чем почки разоблачения. Использование вал стеклянной палочкой, как ограничитель, сила почки через брюшную открытия, нажав на гоэлектронной соседние поверхности. Если отверстие немного меньше, чем почки, почки будет протиснуться открытия и отдыха стабильно на поверхности мыши без дополнительных манипуляций или контакта. Такое расположение является оптимальным для последующих этапов трансплантации. Если отверстие слишком велико, почки вернется в брюшную полость, что затрудняет полное последующих шагов. Влажная поверхность подвергается почки с ледяной стерильной PBS использовании пропитанной хлопка наконечником аппликатором. Повторите этот шаг каждые несколько минут или по мере необходимости, чтобы предотвратить почечную капсулу от высыхания. Использование 27 иглы, сделать 0,2 см разрез через почки капсулы по передней поверхности почки переходе от левой боковой стороны к правой боковой стороне. Использование пламени вытащил стеклянный капилляр трубки зонда, создание мешочек между капсулой почки и почечной паренхимы. Сделайте так, вставив зонд через разрез, сделанный в шаге 5.3.12 и переместить его в заднем направлении по спинно-боковой поверхности почек. Идеальный датчик будет иметь изгиб в ней, который соответствует природным дугу этой поверхности почек. Это позволит зонд добраться до самых задних конца почки, не разрывая открыть большой передней открытия. Важно, чтобы сделать эту сумку, как длинные и узкие, как это возможно. Короткие широкие пакеты не являются идеальными, поскольку они позволяют островков вырваться из капсулы. Длинный и узкий пакеты позволяют островков на хранение по направлению к заднему концу почек с минимальными потерями из капсульного сумке. Получить 25 мкл шприце Hamilton подготовлен в шаге 5.3.6 и двигаться островков к самому краю скошенными открытие гибкой трубки. Вставьте скошенным краем гибкий шланг в субкапсулярной мешочек подготовлен в шаге 5.3.13. Скошенный край должен быть обращен вверх, так, чтобы длинная сторона находится в контакте с паренхимы почек. Перемещение трубки к самым задним концом капсулы. Медленно передачи островки из PE 50 трубку в карман субкапсулярной нажатием на поршень шприца. Как островков заполнить мешок медленно назад гибкая трубка из зарабатывать больше места для островков на хранение. Убедитесь, что все островки передаются от трубку в карман. Не заполняйте мешочек с воздухом или избыток жидкости. После снятия трубки PE 50 из мешочка, используйте пламя вытащил стеклянный капилляр трубки зонда, чтобы аккуратно упаковать островков в проксимальном конце сумке. Сделайте это, скользящие стеклянные датчика вдоль наружной поверхности почки, движущихся в передних к задним направлении. Будьте осторожны, чтобы не пакет островки слишком плотно, как задний конец субкапсулярной сумка может разорваться и выпустить островков. Этот шаг сводит к минимуму потери островки из передней вскрытия, когда почка помещается обратно в брюшную полость. Использование изогнутых щипцов стрелы перитонеальной подкладки, прилегающих к открытию сделано для почек, а затем использовать PBS пропитанной хлопка наконечником аппликатором, чтобы мягко подтолкнуть почек обратно в брюшную полость. Закрыть мыши, применяя швов на брюшную стенку и раны клипы кожного слоя. Вернуться мышь в клетку и повторите шаги с 5.3.4 по 5.3.19 для остальных мышей. Мыши должны быть теплым грелку под клетку или нагрева лампой в глаза защищены, пока мышь полностью оправится от анестезии. Животные должны быть обеспечены acetominophine в воде (6 мг / мл). Проверьте, не натощак уровень глюкозы в крови 24 часа позже. Все мыши, должны быть normoglycemic (глюкоза крови <200mg/dl) в послеоперационный день (POD) 1. 6. Представитель Результаты Две основные процедуры описаны в данном протоколе: (1) островок изоляции и (2) островок трансплантации почек под капсулой. В островок процедуры изоляции, островка дает обычно колеблется между 100-150 островков на мышь в зависимости от возраста и процедить. Чистоту этих островков в отношении их отделение от экзокринных клеток поджелудочной железы может варьироваться в широких пределах каждого препарата. Однако использование комнатной температуре Histopaque1077 в шаге 3.3.7 и 0.1 мм фильтр нейлона в шаге 3.3.17 обычно позволяют в течение более чем 99% чистоты островков. Эта чистота достигается, прежде чем какой-либо дополнительный сбор руку островков. Представитель изображения островков После выделения показаны на рисунке 8D. Как видно из этих изображений, как правило, имеют островки грубой периферические границы сразу же после изоляции. Однако со временем в области культуры, здорового островков будет приобрести и сохранить гладкую границу (рис. 8D). В некоторых островков, центральной некротической области будет развиваться,появляются как темные области в ядре. Этот некротических центре часто исключен из островков в качестве захвачен покадровой съемки (Справочная видео 1). Оставшиеся островки появляются углублением в центре (данные не показаны) и, предположительно, не работают. Таким образом, мы исключаем островки с темным центром в процессе выбора стороны. Важно отметить, что мы обнаружили, что низкие температуры инкубации следующие изоляции процедура (шаг 4.2) может значительно сократить число островков, которая будет разрабатывать центральной некроза в культуре в течение долгого времени. В процедуре трансплантации островков, два шага являются критическими: химическая индукция диабета и поставку островков в почках суб-капсула области. Для диабета индукции, целью является достижение гипергликемическое более чем 90% СТЗ-вводили мышам. Эти мыши выживут без пересадки в течение нескольких недель. Оптимальная доза СТЗ для достижения этой цели изменяется в зависимости от мыши штаммов и возраст, и должны быть определены экспериментально. Мы обнаружили, что разница как малые, как 20mg/kg массы тела может иметь большое значение. Таким образом, титрования с узкими интервалами следует проводить. Для трансплантации островков, ключевым фактором является модели, которые могут иметь четыре иммунологические контекстах: сингенных, аллогенных, сингенных аутоиммунных, и аллогенных аутоиммунные. В сингенных модели, доноры напряжение такое же, как получатель напряжения. Таким образом, островки не вызывающих адаптивно-иммунный ответ из получателей. Это позволяет исследователям изучать вопросы, связанные с "не-первичной функции", термин, относящийся к острову дисфункции и потери из-за причин, кроме специфического иммунного отторжения получателей. Первичная без функции считается основной причиной неудачи в островок ранней стадии трансплантации и для требования большое количество островков (≥ 2 pancreata / пациента), чтобы достичь euglycemia. Таким образом, это важный вопрос для трансплантации островков. В этой модели маргинальных масс островок, который не полностью восстановить нормогликемии следует использовать и мышь должны быть проверены на содержание глюкозы в крови на ранней стадии после трансплантации, как правило, от 1 до POD POD 7. По нашему опыту, маргинальной массы островков, как правило, между 150 и 250 среднего размера островков в 20 грамм получателя использованием C57BL / 6 штамма мышей. С сингенных модели можно использовать генетически измененные или фармакологически островки для проверки частности модуляции влияет на терапевтическую эффективность островков на ранней стадии после трансплантации. В аллогенных и аутоиммунных модели, островок трансплантаты подвергаются специфической иммунной атаки хост адаптивно-иммунитет, который включает в себя Т-лимфоциты, В-лимфоциты и другие клетки иммунной системы. Адаптивная-иммунитет задержки иммунного ответа; в анализе этот ответ, необходимо, чтобы пересадить насыщения число островков, которые эффективно восстанавливает нормогликемии на ранней стадии после трансплантации, чтобы минимизировать воздействие первичных не-функции. Тогда можно контролировать время до островков, отвергаются как показывает потерю нормогликемии для определения влияния любых изменений островков на отторжения трансплантата. По нашему опыту, более 300 островков требуется на 20 грамм мыши и от 15 до 21 дней, отказ время для аллогенной трансплантации использованием Balb / с (Н-2 г) в качестве доноров и C57BL / 6 (H-2 б) получателей. Рисунок 1. Доступ к двенадцатиперстной открытия общего желчного протока. Эндогенные пищеварительных ферментов слива из печени, поджелудочной железы и желчного пузыря через общий желчный проток перед входом в желудочно-кишечном тракте в двенадцатиперстную кишку. Направление потока через этот канал может быть отменено, если давление подается на систему, добавив внешние жидкости. Это приведет к поджелудочной железы становится полной и растянут. Рисунок 2. Зажимные двенадцатиперстной открытия общего желчного протока. Для того, чтобы заполнить поджелудочной железы с Liberase, необходимо, чтобы блокировать двенадцатиперстной открытия общего желчного протока. Если это не достигается должным образом, Liberase заполнит кишечник, а не поджелудочной железы. Рисунок 3. Репозиционирование печень от диафрагмы позволяет визуализировать проксимальной области общего желчного протока. Катетеризация общего желчного протока может быть достигнут наиболее успешно, если она пыталась вблизи ее проксимального конца (в V-форме слияния описанных в 2.3.1). Рисунок 4. Cannulating общего желчного протока путем "свободногорука »методом. Впадения общего желчного протока становится видимым, когда кровоостанавливающего, что зажимается над двенадцатиперстной кишки тянется к заднему концу мыши. Канальные катетеризация может быть достигнуто путем размещения 27 иглы в этом слиянии и вождение через него. Рисунок 5. Cannulating общего желчного протока путем "щипцы помощи" метода. Как уже упоминалось в тексте, иногда фасциальных тканей, окружающих канал затрудняет иглу. () В этих случаях, это полезно для очистки лица слой с 27 иглы. (B) канал может быть четко визуализировать и поддерживается парой изогнутых щипцов руку. (C) С помощью пинцета как ограничитель, 27 иглы может быть вставлен в канал для доставки Liberase. Рисунок 6. Даже расширение поджелудочной железы указывает оптимальное размещение иглы. Учитывая, полупрозрачные характер протока и окружающих тканей фасциальных, в некоторых случаях может показаться, что канал был канюлированные когда на самом деле это не имеет. Если это происходит, и игла проникает в поджелудочной капсулы, двенадцатиперстной области поджелудочной железы начнет расширяться при сдаче Liberase. Тем не менее, вся поджелудочная железа не будет озарен, и это приведет к низкой доходности островок. Чтобы избежать этой проблемы, посмотреть даже для расширения поджелудочной железы специально искали признаки фермента вводе области поджелудочной железы прикреплены к передней части желудка. Рисунок 7. Удаление перфузии поджелудочной железы. Для удаления поджелудочной железы мыши, несколько точек соприкосновения с внутренних органов должен быть разорван. (АВ) Отдельная поджелудочная железа из кишечника. (C) Отдельная поджелудочной железы из желудка. (D) Отдельная поджелудочная железа из кишечника. (EF) Cut оставшиеся контакты с брюшную полость. Рисунок 8. Представителю изображения островков. Относительная чистота и качество островков можно оценить микроскопически после завершения выделения. () В то время целью является очистить от островков поджелудочной железы, экзокринных клеток и мусора иногда присутствует. (В) напряжения островок изоляции может вызвать гибель клеток, что проявляется в виде темных центральные районы острова и отторжения клеток от островка периферии. (C) При выборе островки для эксперимента, избежать сбора загрязняющих клетки экзокринных. (D) Островки изменение внешнего вида с течением времени в культуре. Как островков оправиться от изоляции, они приобретают гладкой боковой поверхности. Иногда в больших островков темно центральной области видна. Эти клетки пятно положительным для гибели клеток. Справочная Видео 1. Временной интервал микроскопии после изоляции островков. В этом 16hr видео промежуток времени островков можно увидеть развивающихся некротических центры, которые в конечном счете, выбрасывается. Пожалуйста, нажмите здесь для видео .