Une méthode pour isoler l'îlot murin et transplantation rénale sous-capsulaires

1. Préparation et étalonnage des réactifs Libérase Ce protocole utilise Libérase TL (Roche, Cat # 05 401 020 001) d'enzymes pour la digestion pancréatique. Achat 100-200mg à la fois et faire un grand lot. Re-suspendre poudre lyophilisée dans de l'eau de qualité CLHP stérile afin que la concentration est d'environ 26 unités par ml Wünsch. Ce devrait être d'environ 5 mg / ml. Voir la notice pour plus de détails sur les unités Wünsch contenues dans le lot spécifique. Placer les flacons sur la glace pendant 30 minutes avec Gentile tourbillonnant toutes les quelques minutes. Vérifiez poudre soit complètement dissoute à la fin de 30 minutes. Piscine tous les Libérase dissous ensemble et mélanger en remuant doucement (ne pas vortexer ou secouer). Aliquoter 24,3 unités Wünsch de pré-réfrigérée tubes Eppendorf, congélation rapide sur l'azote liquide (le traiter comme n'importe quel enzymes) et stocker à -80 ° C. Ce devrait être d'environ 0.935ml par tube Eppendorf. Chaque aliquote est à usage unique (suffisant pour 11 souris) et ne doivent pas être stockées ou re-congelé une fois décongelé. En général, le stock est stable pendant au moins 6 mois. Pour chaque nouveau lot, de calibrer le temps d'incubation optimal. Utilisez le stock congelé, pas le stock fraîchement dissous, pour l'étalonnage, pour imiter les conditions réelles d'expérimentation, autant que possible. Calibrer le bain d'eau que vous prévoyez d'utiliser exactement 37 ° C en utilisant un thermomètre à mercure. Utilisez le même incubateur dans des expériences futures. Avant d'utiliser, décongeler un tube de Libérase sur la glace et ajoutez-le (0.935ml) pour 21.6ml sérique RPMI gratuitement, ce qui rend la concentration de travail finale 1,08 unités par ml Wünsch. Sérum, BAS et l'EDTA inhibe Libérase. Le zinc et le calcium sont des cofacteurs. Store sur la glace et utiliser dans les 1,5 heures. Cela est suffisant pour environ 11 souris (2ml/mouse). Voir l'étape 2.3 pour perfusion pancréas. Perfuser que des souris que possible dans 1 hr. Ensuite, utilisez une ou deux souris pour chaque temps d'incubation et d'essai de 10, 12, 14, 16, temps d'incubation 18 minutes. Si possible, incluez des intervalles de 30 secondes entre le temps que le calendrier de la digestion est très important. Remplir le protocole d'isolement des îlots et d'analyser le rendement et la qualité des îlots de chaque point de temps d'incubation. Finalement, le rendement ne devrait pas trop changer entre les périodes de pointe, mais la qualité des îlots à ces intervalles peuvent varier. Pour les expériences ultérieures, utiliser les conditions qui entraînent le plus grand nombre d'îlots qui sont sains 48 heures après l'isolement. L'âge de la souris semble affecter le temps d'incubation optimal. Ainsi, l'utilisation des souris dans une tranche d'âge similaire. Idéalement, utilisez 8-12 souris semaine; cependant, même de 80 à 10 mois des souris âgées peuvent donner de bons îlots. À des fins de calibrage, utiliser les jeunes souris. 2. Procédure chirurgicale Préparer tous les équipements et les médias avant que l'euthanasie des souris donneuses d'îlots. Autoclave ou une flamme stériliser les instruments avant de les utiliser. Tous les réactifs et d'instruments (toucher les échantillons) doit être stérile. L'isolement et la cueillette à la main d'îlots peut être effectué en dehors d'une hotte à flux laminaire sans augmenter l'incidence de la contamination. Toutefois, la stérilisation des outils qui viennent en contact avec le pancréas ou îlots est essentiel pour éviter la contamination. Les outils suivants sont nécessaires: 1 paire de ciseaux pour disséquer incision abdominale. 2 paires de pinces. 1 pince hémostatique pour clamper le canal biliaire. 0.419 treillis mm de diamètre. Filet de nylon 0,1 mm de diamètre. Pliez plusieurs aiguilles de calibre 27 de sorte qu'un angle de 70 degrés est introduit à mi-chemin sur la longueur de l'aiguille. Le bord biseauté de l'aiguille doit faire face à l'intérieur du coude. Remplissez un vaporisateur avec de l'éthanol à 70%. Mettre en place un microscope à dissection avec une source de lumière adéquate sur une paillasse de laboratoire ou dans une hotte. Pré-froid centrifugeuse à 4 ° C. Centrifugeuse doit avoir un rotor à godets swing, être capable de 900xG, être réfrigérés, et faites une pause qui peut être débrayé. Sur un Sorvall RT6000D avec le rotor Sorvall H1000B, une vitesse de 2400rpm 900xG est. Ralentissement spins sont fait à 800RPM. Placer les réactifs suivants sur la glace. RPMI (1 litre de sérum de 10%) RPMI (200ml sans sérum) 50ml tubes coniques (1 pour chaque pancréas) Seringue de 5 ml. Equilibrer Histopaque1077 à la chambre de Temperature. Dégeler une aliquote de l'usage unique Libérase calibré sur la glace et le diluer dans du sérum 22.5ml RPMI libre. Sérum, BAS et l'EDTA inhibe Libérase. Le zinc et le calcium sont des cofacteurs. Store sur la glace et utiliser dans les 1,5 heures. Cela est suffisant pour environ 11 souris (2ml/mouse). Chaud 37 ° C l'eau de bain. Ayez sous la main comme des souris que vous pouvez cathétériser en 1 heure (environ 10 – 18 souris). Préparer la souris pour canulation. Premièrement euthanasier la souris par dislocation cervicale ou CO 2 asphyxie. Alors que la souris est expirant, remplir la seringue 5ml avec 2ml d'actions Libérase de travail (1,08 unités Wünsch / ml). Placez la souris en position couchée sur une serviette en papier à la portée de dissection et de pulvérisation de l'abdomen à l'éthanol 70% avant l'ouverture de son abdomen avec un V-incision de la région pubienne à la fois aux pattes avant. Repliez la peau sur la poitrine pour révéler la cavité abdominale. Placez la souris avec la tête pointant vers vous. Recherchez l'entrée du duodénum du canal cholédoque comme l'a souligné sur la figure 1. Cela peut être fait sans regarder à travers l'objectif microscope à dissection. Clamp l'ouverture duodénale avec hémostatique tel que démontré sur la figure 2. Position de serrage est essentiel pour bloquer le flux d'Libérase dans les intestins. Si pince est trop élevée ou trop basse, Libérase ne sera pas perfuser le pancréas. Hémostatique position, de sorte que lorsqu'il est comprimé, il fonctionne exactement le long de la frontière du pancréas / intestin. Avant cannulating le canal cholédoque, il peut être nécessaire de repositionner le foie en le pressant contre le diaphragme, de sorte que toute la longueur de la voie biliaire commune est exposée (figure 3). Une fois la longueur de la voie biliaire exposées, utiliser la pente de 27 gague aiguille fixée à la seringue remplie pour Libérase canulation. Il existe deux techniques pour cannulating les voies biliaires. Dans la première technique, ou une méthode "main libre", la pince hémostatique serrée sur le duodénum est arrachée de la tête de la souris vers la queue de telle sorte que le canal cholédoque devient tendue. Il ya une confluence dans la fermeture des voies biliaires dans le foie où la bile s'écoule de la vésicule biliaire et des enzymes du foie se réunissent avant d'entrer dans les intestins. L'intérieur du V formé par cette confluence est exposé en tirant sur le canal biliaire serré et est un endroit idéal pour initier canulation du canal (figure 4). Si correctement positionné, l'aiguille va glisser à droite à travers le V, et directement cathétériser la portion inférieure de la gaine. Insérez le millimètres d'aiguille dans le canal de plusieurs avant de distribuer l'Libérase. Placement de l'aiguille Optimal est important pour empêcher le retour dans le foie et la vésicule biliaire. En outre, il est important que l'aiguille ne pas être inséré si loin que cela obstrue le conduit splénique. Le conduit splénique est difficile de voir une branche de la cholédoque et il draine la queue splénique du pancréas, une zone riche en îlot. Si l'aiguille glisse au-delà de l'ouverture pour le conduit de la rate, il y aura moins de perfusion complète de la queue de la rate et la digestion potentiellement réduite de cette région. Le rendement optimal des îlots se produit lorsque la profondeur de votre aiguille est assez loin qu'aucun Libérase échappe à la vessie foie / vésicule, mais pas si loin que vous avez passé le conduit splénique. Vous pouvez tester canulation succès en distribuant une petite quantité de Libérase. Si vous voyez le Libérase remplissant le conduit ensuite passer le reste de la 2mls. Si la zone autour de la gaine commence à se remplir, arrêter la distribution, de repositionner l'aiguille, et essayez de nouveau. Dans la deuxième technique, ou «pince assister» méthode, l'hémostatique serrée sur le duodénum est arrachée de la tête de la souris vers la queue de telle sorte que le canal cholédoque devient tendue. Puis, en utilisant la pente de 27 gague aiguille fixée à la seringue 5ml, percer le fascia-dessous de la voie biliaire principale à proximité du foie. Utiliser l'aiguille pour effacer la aponévrose de la gaine (figure 5). Avec l'aiguille reste en place, réglez la pince hémostatique baisser pour ramasser une paire de pinces. Utilisez un bras de la pince ouverte pour soulever le canal biliaire où l'aiguille a autorisé, le fascia. Les crêtes de la pince à créer une des voies que vous pouvez utiliser pour guider l'aiguille dans le canal. Tout en tirant sur la gaine et pince vers vous, faites glisser l'aiguille dans le canal à l'aide de la pince comme un filet de sécurité. Test de canulation en dispensant une petite quantité de Libérase. Si le canal commence à se remplir (FIG.5 Arrow), dispenser le reste de la 2mls. Si la zone autour de la gaine commence à se remplir, arrêter la distribution, de repositionner l'aiguille et essayez à nouveau. Comme le 2mls des Libérase remplit le pancréas, la zone près du duodénum commence à se dilater en premier, suivie par la région sur le dessus de l'estomac, et enfin la queue splénique (Fig. 6). Regarde, même pour l'expansion du pancréas (Fig.6). Si une région commence à se développer et vous ne voyez pas le tissu blanc uniformément étendre et étaler, il est probable que le canal cholédoque n'a pas été une canule, et pourtant l'aiguille est à l'intérieur de la capsule pancréatique. Remplissage de la capsule avec Libérase n'entraînera pas un rendement élevé que l'îlot de la surface exposée à l'enzyme sera faible. Si cela se produit, arrêter la perfusion et de repositionner l'aiguille. Une fois que le pancréas a été perfusé, il peut être retiré de la souris en la tirant sans les points de contact avec les intestins, l'estomac et la rate. Commencez par enlever la pince hémostatique du duodénum. Ensuite, utilisez la pince pour soulever le duodénum et le pancréas de séparer les intestins avec une deuxième paire de forceps (FIG.7A-B). Ceci est fait en tenant la seconde paire de pince régulière tout en tirant les intestins de l'abdomen. Ensuite, tirez le pancréas gratuitement à partir du haut de l'estomac et la rate (FIG.7C-D). Enfin, soulevez le pancréas hors de l'abdomen et couper le libérer de la aponévrose connexions restantes (FIG.7E-F). Placez le pancréas dans un tube 50ml conique et le laisser sur la glace tout en travaillant sur les autres souris. Démarrer une minuterie 1 heure. Pour un rendement maximal des îlots, seul endroit où une pancréas dans chaque tube. Il n'est pas recommandé de laisser le pancréas perfusé sur la glace pendant plus de 1 heure, selon le Libérase va commencer à se dégrader le tissu. A la fin de l'heure, rapidement passer à l'étape 3.0 pour tous les pancréas qui ont été perfusés. Répétez les étapes 2.3 à 2.6 pour les souris restantes ou jusqu'à ce que la minuterie 1 heure a commencé à l'étape 2.6 a expiré. 3. Ilots purifiant du pancréas perfusé Avant les îlots peuvent être purifiés par le pancréas, les tissus doivent être digéré à 37 ° C. Groupe des tubes 50ml portant les îlots perfusé dans un rack à fond ouvert qui s'insère dans le bain à 37 ° C. S'assurer que tous les bouchons sont bien fixées et tubes plonger dans le bain d'eau à 37 ° C pour le montant précis des temps pré-déterminé pour le lot courant des Libérase (Voir étape 1.4). A la fin de l'incubation, de déplacer les tubes à la glace et ajouter RPMI1640 avec 10% de sérum à 20mls par tube. Sérum contenant des médias va arrêter la digestion Libérase. Dissocier le tissu en secouant les tubes vigoureusement 40 fois en 10 secondes. Cette étape est essentielle pour une récupération optimale des îlots. Même avec une perfusion Libérase optimale et le temps de digestion bien calibré, le rendement des îlots sera faible si le tissu n'est pas rompu. La manipulation agressive des échantillons dans cette étape ne semble pas nuire à la souris et îlots est nécessaire pour les libérer de grappes de cellules exocrines. Pour séparer les îlots du pancréas digéré, suivez les étapes suivantes. Piscine digérés pancréas afin qu'il n'y ait environ 2,5 pancréas par tube. En agissant ainsi, dix tubes seront condensées à 4 tubes avec 50ml de médias chacun. Centrifuger les tubes pendant 2 minutes à 800RPM et 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre les boulettes dans 15 25mls médias avec FBS à 10% par vortex doucement (régler l'intensité de vortex à environ 50% du maximum) pendant plusieurs secondes. Verser le coulis en suspension à travers le grillage 0.419mm et de l'entonnoir dans un nouveau tube 50ml conique. Cette sépare les tissus non digérés, la graisse et la lymphe. Rincer le tube avec une 10mls supplémentaire de milieu contenant 10% de FBS et versez dans le treillis. Répétez ce processus pour les tubes restants. Centrifuger les tubes pendant 2 minutes à 800RPM et 4 ° C. Décanter le surnageant et soigneusement inverser les tubes sur un papier absorbant. Regarder pour s'assurer que les îlots ne pas glisser. Essuyez l'intérieur des tubes avec une serviette en papier pour enlever les médias résiduelles, en faisant attention à ne pas perturber le culot cellulaire. Retour tubes en position verticale. Resuspendre les pastilles dans 5 ml de histopaque1077 température ambiante par vortex doucement pendant quelques secondes. Assurez-vous que la suspension est homogène avant d'ajouter une supplémentaire de 5mls histopaque autour de l'intérieur du tube. Ce lave les îlots au large de la paroi du tube. Superposition histopaque avec 10mls de sérum sans RPMI, en veillant à maintenir une interface nette entre le histopaque et des médias. Ajouter les médias par pipetage lentement le long du côté du tube à un taux de 1ml par 10 secondes. Les médias devraient être sur le dessus, et histopaque sur le fond. Sérum affecte la densité des médias et ne doivent pas être utilisées pendant cette étape. Spin échantillons dans une centrifugeuse équilibré à 20 ° C à 2400rpm (900xG) pendant 20 minutes avec une accélération très lente et pas de freinage. Cette étape sépare les îlots à partir des cellules exocrines. Les îlots vont migrer à l'interface entre les médias sérique libre et Histopaque tandis que les cellules exocrines wiLL forment un culot au fond du tube. Recueillir les îlots de l'interface histopaque / media avec une pipette 10ml jetables sérologique. Ilots collera au verre, donc pipettes en verre ne doivent pas être utilisés à moins qu'ils n'aient été siliconé. Placez îlots dans un nouveau tube 50ml conique. Plusieurs tubes peuvent être regroupées à cet endroit. Remplir les tubes à 50 ml avec du RPMI contenant du sérum. Centrifuger les tubes pendant 2 minutes à 800RPM et 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension les îlots dans 50ml de RPMI contenant du sérum par vortex doucement. Centrifuger les tubes pendant 90 secondes à 800RPM et 4 ° C. Décanter le surnageant et répéter laver les temps 1 de plus. Décanter le surnageant et de prendre des tubes à la hotte de culture de tissus. Ajouter stylo / streptocoque au RPMI contenant 10% de FBS à une concentration finale de 1% pour les milieux de culture d'îlots. Resuspendre les îlots de 5 ml de ce média de la culture. Inverser une passoire en nylon 0.1mm cellule et le placer sur un tube de 15ml conique. Lentement passer le coulis îlot resuspendues à travers la passoire. Les îlots seront retenus par le tamis tandis que les cellules exocrines passer dans le tube 15ml conique. Cette étape augmente considérablement la pureté des îlots à l'égard de la contamination de cellules exocrines, à la fin du protocole. Rincer le tube 50ml conique avec une 6mls supplémentaires des médias et la pipette à travers la passoire. 3mls place de milieux de culture comme une grosse goutte dans un plat de 10 cm de Pétri. Inverser le côté droit jusqu'à la crépine de cellule, de sorte que la surface utilisée pour capturer les îlots peuvent être plongés dans la goutte médias. Toucher le filtre pour les médias vont transférer la plupart des îlots dans une culture non-tissu traité boîte de Pétri. Utiliser un plat de Pétri non traitée est essentiel pour éviter l'adhérence des îlots et la dispersion à la surface de la plaque. Gratuit îlots flottants sont beaucoup plus facilement pris pour la séparation en groupes expérimentaux. Pipeter un supplément de 5-7mls de milieux de culture à travers le filtre dans la boîte de Pétri pour laver toute îlots résiduels hors de la crépine dans le plat. Vérifiez le rendement et la qualité des îlots dans un objectif 4x sur un microscope inversé. Swirling le plat dans un ovale serrée permettra de recueillir les îlots au centre du plat. Si les îlots semblent bonnes, ils peuvent soit être pris immédiatement à des fins expérimentales ou séparés également entre 4-6 boîtes de Pétri de 10 cm (par 10 souris). La culture des îlots de trop dans le même plat entraîne les îlots à se nécroser et se dégradent. Pour les expériences, 250-300 îlots par plat 6cm avec 2-3mls des médias ne semble pas le stress des îlots. Il y aura quelques îlots utilisable dans le tube 15ml conique qui collecte les flux de nylon 0.1mm cellulaire filtre à travers. Ces îlots peuvent être récupérés après trois à quatre coups de sédimentation par gravité. Après environ 4 minutes de sédimentation, aspirer tous mais environ 1ml de médias dans le tube et le remplir au sommet avec les milieux de culture. Boucher le tube et renverser pour mélanger. Répétant ce processus plusieurs fois supprime la plupart des cellules exocrines seule cellule qui sont lents à sédiments, et enrichit les agrégats plus lourds des cellules endocrines (îlots) qui couler rapidement. Après l'aspiration finale, remettre en suspension dans 7mls de milieux de culture et de la plaque dans une boîte de Pétri frais. 4. Travailler avec des îlots isolés Le processus d'isolement est assez stressant sur ​​les îlots; HISTOPAQUE est toxique, des tremblements et des étapes de centrifugation induire un stress pure, et le retrait de l'approvisionnement en sang hôte ainsi que la culture in vitro peut induire une hypoxie. Nous et d'autres ont montré que l'isolement induit la mort des cellules bêta 4-5. L'effet de ces contraintes est perçue par la desquamation des cellules de la périphérie de l'îlot et le noircissement et l'expulsion du noyau central de l'îlot (nécrose centrale). Alors que la desquamation des cellules de la périphérie peut être tolérée, la nécrose centrale de l'îlot qu'il disqualifie pour une utilisation dans des expériences. Généralement, plus l'îlot, plus les chances que la nécrose centrale sera un problème. Les efforts visant à réduire la réponse de l'îlot de l'après isolement de stress va augmenter le rendement d'îlots utilisable. Par conséquent, nous utilisons une technique d'incubation indiqué précédemment les îlots dans un incubateur à 22-27 ° C la culture de tissus pour les 48-72 premières heures suivant l'isolement 6-8. Cette température réduite amortit la réaction au stress îlots et adoucit leur transition vers la culture in vitro. Si un 22-27 ° C incubateur de culture tissulaire n'est pas disponible, il est possible d'atteindre la plage de température souhaitée dans une norme incubateur de culture tissulaire en désactivant le contrôle thermique et de placer environ £ 20 de labriques congélateur équilibré à -80 ° C. Il en résulte environ 16-24 heures de la température réduite dans l'incubateur. Remplacer les briques -80 ° C congélateur au besoin. Nous n'avons pas observé un avantage additionnel d'incubation à cette température inférieure plus longue que 72 heures. En plus de l'incubation à basse température, nous recommandons de changer les 24-48 heures après les médias l'isolement. Facteurs sécrétés par îlots souligné et morts s'accumulent dans les médias l'isolement suivantes et peut favoriser le stress îlot supplémentaire. Pour changer de support, procédez comme suit. Transfert des médias et des îlots de la boîte de Pétri d'un tube de 15ml conique aide d'une pipette en plastique. Laver la plaque avec un 3mls supplémentaires de milieux de culture pour recueillir îlots résiduels. Ajouter cette 3mls supplémentaires pour le tube 15ml conique et permettent aux îlots de sédiments par gravité pour 5min. Aspirer tous, mais 1ml des médias du tube 15ml conique, puis remettre en suspension les îlots dans 4mls de milieux de culture d'îlots. Transfert des îlots et des médias à une plaque fraîche de Pétri. Ajouter une 3mls supplémentaire de milieux de culture pour le tube 15ml conique pour recueillir toute îlots résiduels et ajouter cela à la plaque de Pétri. Changer les médias îlot tous les trois à cinq jours après. Lors de la cueillette des îlots pour une expérience, il n'est pas recommandé de mélanger des isolements d'îlots différents. La base moléculaire de ces îlots est influencé par beaucoup de choses, y compris la quantité de temps qu'ils ont été dans la culture et le stress d'isolation qui varie d'une préparation à la préparation. Pour réduire la variabilité, les expériences des îlots doit être effectuée sur des îlots qui ont été isolés dans le même temps. Cependant, si cela n'est pas possible, nous suggérons fortement la mise en commun tous les îlots en un seul groupe avant de les ramasser pour les expériences. Pour choisir îlots pour des expériences, suivre les étapes suivantes. Si les îlots sont en incubation dans plus d'un plat, la piscine tous les îlots dans un plat unique en suivant les étapes 4.3.1 à 4.3.5 ci-dessus. Si plusieurs plats d'îlots sont impliqués, un tube de 50ml conique doit être utilisé au lieu du tube de 15ml. Cela peut réduire la variabilité induite par des différences subtiles dans les conditions de culture entre les plaques pendant la période de récupération post-isolement. Pendant sédiments gravité des îlots, mis en place un microscope inversé équipé d'un objectif 4x ou 10x. Recueillir une micropipette P200 et une boîte de stériles p200 conseils. Transfert des îlots sédimentées à une seule plaque et déplacer la plaque au microscope. Agiter le plateau pour recueillir des îlots dans le centre. Retirez le couvercle à la plaque et l'utilisation de la pipette P200 pour ramasser îlots sains. Îlots sains ont pensionnaires lisse et aucune région centre sombre (figure 8). Essayez de maintenir une répartition uniforme de la taille des îlots à travers des plats expérimentaux comme la taille des îlots peuvent modifier la réponse au traitement. Le nombre d'îlots par groupe expérimental peut varier en fonction des besoins de l'expérience. Nous estimons que l'un îlot dispose d'environ 1000-2000 cellules et produira 0,3 1 pg de protéines et de 25 ng d'ARN total. Pour les essais in vitro, un groupe typique d'expérimentation peut être comprise entre 100 et 250 îlots plaqués en 35mm ou 6cm plats avec 1-3ml de médias. Pour la greffe, chaque souris receveuse, il faudra entre 150 et 400 îlots en fonction de la conception expérimentale (Voir l'étape 5.2.2 et de discussion pour plus de détails). Afin de minimiser les variations introduites par le processus de vendange manuelle, on utilise l'orifice de la pointe du P200-pipette comme un guide pour estimer la taille de l'îlot. La plupart des îlots ont un diamètre d'environ la moitié du diamètre de l'orifice, et nous comptons chacun d'eux comme un îlot standard. Toute îlots plus grands ou plus petits que cela, nous assignons un décompte des îlots différents conséquence. Nous recueillons des îlots dans des lots de 20-50 et de les transférer vers les plats désigné expérimental. Si le P200-pipette est fixé à au volume de 180 microlitres, on peut collecter des îlots multiples (généralement plus de 50 îlots) en une seule pointe. Ainsi, même si les îlots sont cueillies une à une, on peut recueillir de nombreux îlots au sein de chaque p200-tip en contrôlant le mécanisme de libération Pipetman. Cela facilite la cueillette des centaines, voire plus d'un millier d'îlots nécessaire aux expérimentations. Nous utilisons aussi cette opération en discontinu pour aider à équilibrer la distribution des îlots de qualité et de taille semblables. 5. Sous-capsulaires Islet Transplantation rénale Induire un diabète chez la souris greffée. Placez la souris sur un jeûne de 4 à 6 heures. Les receveurs de greffe optimale devrait se situer entre 6 à 10 semaines et pèsent 20 à 25 grammes au moment de jeûne. Pour faire défiler rapidement les souris, enlever la nourriture de la feediporte-ng et toujours placer la souris dans une cage de frais. Cela assure un vrai jeûne, en séparant les souris de tous les bits résiduels d'aliments qui peuvent avoir déjà tombés dans leur cage. Plan de 80% à 90% des souris de devenir diabétique. Trois heures dans le rapide, préparer le tampon citrate de sodium. Peser 0.735g de citrate de sodium enzyme grade (citrate de Na, M. 294,10 g / mol) et le dissoudre dans de l'eau déminéralisée 25mls stérile. Ajuster le pH à 4,5 avec HCl. Ce tampon doit être préparée pour chaque tour des expériences. Placer 0.05g streptozotocine (STZ, M r 265,2 g / mol) dans un tube Eppendorf de 1.5 ml. Cette quantité est suffisante pour induire le diabète chez environ 8 souris. Préparer un nombre suffisant de tubes 1.5ml pour le nombre de souris à injecter. STZ est photosensible, donc couvrir chaque tube avec du papier d'aluminium. Après 4 heures de jeûne, resuspendre un tube de STZ avec 1ml d'fraîchement Na tampon citrate. Une fois remis en suspension, la solution de citrate de Na-STZ perd son activité dans les 15 à 20 minutes, donc cette étape ne doit être faite immédiatement avant l'injection, les souris. Injecter chaque voie intrapéritonéale à la souris avec un volume approprié de la solution de citrate de Na-STZ pour atteindre une dose finale de 190mg/kg de la souris. Cette dose peut varier selon la souche et l'âge de la souris, donc il peut être nécessaire d'effectuer une optimisation de la dose si l'incidence du diabète est trop faible ou si les souris Trop de gens meurent dans les 3 à 5 jours après l'injection. Doses couramment utilisées vont de 150mg/kg de la souris pour la souris 250mg/kg. L'approvisionnement alimentaire et l'eau une fois toutes les souris ont été injectés. Test de la souris non à jeun hyperglycémie (> 350mg/kg) 2 à 4 jours après l'injection. Les souris qui démontrent 3 jours consécutifs de non-jeûne hyperglycémie peut être utilisé comme receveurs de greffe. Préparer îlots pour la transplantation Isoler îlots comme décrit ci-dessus dans les étapes 2.0 à 4.0. Si nécessaire, les îlots peuvent être isolés sur le jour de la transplantation ou avant. Choisissez îlots en groupes pour la transplantation en les plaçant dans des tubes Eppendorf stériles 1.5ml. Garder les tubes sur la glace. Le nombre d'îlots nécessaires pour rétablir une glycémie normale peut varier étant donné les conditions de l'expérience (souche donneuse d'îlots, de poids et de la souche du destinataire, et tous les traitements supplémentaires donnés aux bénéficiaires) et la personne qui ramasse les îlots. La taille de la souris receveuse est une variable importante qui influe sur nombre d'îlots minime, que les grandes souris, il faudra plus d'îlots. Nous avons constamment trouvé que 150 à 250 îlots que marginalement restaure normoglycémie tandis que 300 îlots ou plus est curative dans un 18 à 20gram C57BL / 6 souris receveuse. Dans ces expériences, les souris donneuses îlot ont été soit C57BL / 6 ou Balb / c. Îlots transplantation rénale au sac capsulaire Assembler les matériaux suivants (tous les instruments chirurgicaux doivent être stérilisés): Tableau 1. Equipement pour la transplantation 25 pi seringue Hamilton 6 "du PE 50 tubes flexibles de sorte coupé un côté biseauté Gel de chargement et P200 pipette Stérile Eppendorf tubes (1 par bénéficiaire) Vaporisateur isoflurane et l'isoflurane Eppendorf tube de support McPherson Vannas Ciseaux (1) Pince bras plié (2) Hémostatiques (1) Clip plaies avec des clips Aiguille de calibre 27 Flamme tiré des sondes de verre capillaire * Coton-tige applicateurs 50ml tube conique de PBS stérile Sutures Cisailles électriques 70% d'éthanol Vaporisateur Stylo à bille Betadine claires drapé plastique stérile * Remarque: Lors de la préparation de ces sondes, tenter de créer un arc dans la sonde qui imite l'angle du rein de souris. En outre, s'assurer que la fin de la sonde est suffisamment polie flambé de telle sorte que pas d'arêtes vives existent. Peser et étiqueter tous les souris receveuses diabétiques. Attribuez à chaque souris à un groupe expérimental avant la transplantation afin que chaque groupe a lui aussi adapté le poids corporel. Mettre en place un champ opératoire au sein d'un capot avant ouverte équipée avec la sortie des gaz du vaporisateur isoflurane. Anesthésier un souris receveuse à l'isoflurane et puis raser le flanc avec le sécateur électrique. Raser la souris en dehors de la zone où les greffes seront effectuées. Retour de la souris pour l'anesthésie et la position qu'il perpendiculaires à et directement sur l'arbre d'une tige de verre afin que le flanc rasé vers le haut. Vaporiser le flanc à l'éthanol 70%. La souris doit être préparée avec un lavage chirurgical de l'alternance bétadine et de l'alcool à trois reprises. Drapé de la souris avec champ stérile claires permettant d'accéder au flanc rasé. Préparer les îlots pour la transplantation tandis que la souris est anesthésiée. Pour ce faire, en complétant les étapes suivantes. Placer un bout gel stérile de chargement dans l'ouverture d'un tube de 1,5 ml Eppendorf afin qu'il y ait une courbure douce qui fait une forme de U dans l'extrémité étroite de la pointe. L'ouverture de la pointe doit être orienté directement vers le haut du tube Eppendorf. Ne pas introduire un coude à tout moment de la pointe de chargement de gel que cela se traduira par cisaillement des îlots et une réduction du nombre d'îlots qui sont transplantés. Retirer délicatement la glace d'un tube d'îlots qui a été préparé à l'étape 5.2.2. Tous les îlots doivent être déposés au fond du tube. Avec une pipette P200, doucement recueillir les îlots dans un volume minimal de la partie inférieure du tube. Transférer ces îlots par la grande ouverture de la pointe de chargement de gel préparé à l'étape 5.3.6.1. Les îlots devraient s'installer dans la durée étroites ou restriction étroite de la pointe de chargement de gel. Après les îlots ont sédimenté, enlever autant de médias de la pointe de chargement de gel que possible. Ceci peut être accompli en utilisant une pointe gel frais de chargement jointes à une pipette P200 par l'aspiration du média par la grande ouverture de la pointe îlot portant gel de chargement. Transfert des îlots sédimentées dans le PE 50 tubes flexibles (~ 15cm de longueur). Cela peut être fait en commençant par fixer l'extrémité non biseautée de tube à l'ouverture étroite de la pointe îlot portant sur gel de chargement avant d'attacher l'extrémité d'une pipette P200. Les îlots peuvent ensuite être poussé à travers 60% de la longueur de la tubulure. Transfert le roulement des îlots PE 50 tubes de 25 pi à une seringue Hamilton. Assurez-vous que le piston a été retiré avant le transfert du tube. Connectez le bord non biseauté de la PE 50 tube de l'aiguille de la seringue. Enfoncer le piston de la seringue jusqu'à ce que les îlots sont d'environ 0.5cm loin de l'ouverture en biseau. Régler la seringue de côté afin que les îlots peuvent régler en une seule masse près de l'ouverture en biseau du tube tandis que le rein est d'être prêt à recevoir les îlots. Avec vos doigts, de localiser le rein à travers la peau de la souris sous anesthésie. L'arbre de la stylo à bille doit être directement sous la zone où le rein est situé et positionné perpendiculairement à la moelle épinière. Une fois que le rein est localisé, utiliser les ciseaux McPherson Vannas de faire une incision de 2cm à travers le derme directement au-dessus dans une direction perpendiculaire à la moelle épinière. Cette incision va exposer la paroi péritonéale. Avec les ciseaux McPherson Vannas faire une incision de 1 cm à travers la paroi péritonéale dans la même direction que le couper à travers la couche cutanée. Il est important que l'ouverture créée par cette incision sera plus petit que le rein d'être exposé. En utilisant l'arbre de la tige de verre comme un filet de sécurité, la force du rein par l'ouverture péritonéale en appuyant sur ee surface adjacente. Si l'ouverture est légèrement plus petit que le rein, le rein se faufiler dans l'ouverture et la reposer de façon stable sur la surface de la souris sans aucune manipulation supplémentaire ou contact. Ce positionnement est optimal pour les étapes ultérieures de transplantation. Si l'ouverture est trop grande, le rein va retomber dans la cavité péritonéale, ce qui rend difficile pour compléter les étapes ultérieures. Mouiller la surface du rein exposée avec PBS glacé stérile à l'aide d'un coton imbibé applicateur incliné. Répétez cette étape toutes les quelques minutes ou au besoin pour empêcher la capsule rénale de se dessécher. Utilisation de l'aiguille de calibre 27, faire une incision 0.2cm travers la capsule du rein à travers la face antérieure du rein passant du côté latéral gauche vers le côté latéral droit. Utiliser la flamme tiré de sonde capillaire en verre, de créer une poche entre la capsule du rein et du parenchyme rénal. Le faire en introduisant la sonde à travers l'incision faite à l'étape 5.3.12 et le déplacer dans une direction postérieure le long de la surface dorsale-latérale du rein. Une sonde idéal aura un virage dans ce qui correspond à l'arc naturel de cette surface du rein. Cela permettra à la sonde pour atteindre l'extrémité la plus postérieure du rein sans déchirer une grande ouverture antérieure. Il est important de faire cette pochette en long et étroit que possible. Court sachets larges ne sont pas idéales car elles permettent îlots de s'échapper de la capsule. Longue et étroite sachets permettent les îlots d'être déposé vers la fin postérieure du rein avec une perte minimale de la poche capsulaire. Récupérez la seringue Hamilton 25 pi préparé à l'étape 5.3.6 et déplacer les îlots au bord même de l'ouverture en biseau du tube flexible. Insérez le bord biseauté de la tuyauterie flexible dans la poche capsulaire préparé à l'étape 5.3.13. Le bord biseauté doit être orientée vers le haut, de sorte que le bord long est en contact avec le parenchyme rénal. Déplacer le tube à l'extrémité la plus postérieure de la capsule. Lentement transférer les îlots de la PE 50 tube dans la poche capsulaire en appuyant sur le piston de la seringue. Comme les îlots de remplir la poche lentement le tube flexible en faisant plus de place pour les îlots à être déposés. S'assurer que tous les îlots sont transférés du tube dans la poche. Ne pas remplir le sac d'air ou d'excès de liquide. Après avoir retiré le tube de PE 50 de la pochette, l'utilisation de la flamme tiré sonde tube capillaire en verre d'emballage délicatement les îlots dans l'extrémité proximale de la poche. Pour ce faire, en glissant la sonde de verre le long de la surface extérieure du rein se déplaçant dans une direction avant vers l'arrière. Soyez prudent de ne pas emballer les îlots trop serré que l'extrémité postérieure de la poche capsulaire peut se rompre et libérer les îlots. Cette étape minimise la perte d'îlots de l'ouverture antérieure de la poche quand le rein est placé à l'intérieur de la cavité péritonéale. En utilisant une pince bras plié lever le péritoine adjacent à l'ouverture faite pour le rein et ensuite utiliser un coton imbibé PBS applicateur incliné pour pousser doucement le rein dans la cavité péritonéale. Fermer la souris par l'application de sutures à la paroi péritonéale et clips blessure à la couche dermique. Retour de la souris dans sa cage et répétez les étapes 5.3.4 à 5.3.19 pour les souris restantes. Les souris doivent être gardés au chaud avec un coussin chauffant sous la cage ou une lampe de chauffage avec les yeux protégée jusqu'à la souris récupère pleinement de l'anesthésie. Les animaux doivent être fournis avec acetominophine dans l'eau (6 mg / ml). Vérifiez non à jeun le sang les niveaux de glucose 24 heures plus tard. Toutes les souris doivent être normoglycémiques (glycémie <200mg/dl) à jour post-opératoire (POD) 1. 6. Les résultats représentatifs Deux principales procédures sont décrites dans ce protocole: (1) l'isolement des îlots pancréatiques et (2) la transplantation d'îlots sous la capsule rénale. Dans la procédure d'isolement des îlots, des îlots rendements varient généralement entre 100-150 îlots par souris en fonction de l'âge et la fatigue. La pureté de ces îlots à l'égard de leur séparation à partir des cellules exocrines du pancréas peut varier largement entre chaque préparation. Cependant l'utilisation de Histopaque1077 température ambiante à l'étape 3.3.7 et un filtre en nylon de 0,1 mm à l'étape 3.3.17 permettent généralement supérieur à 99% de pureté d'îlots. Cette pureté est réalisée avant toute cueillette manuelle supplémentaires d'îlots. Des images représentatives de l'isolement des îlots suivants sont présentés dans la figure 8D. Comme vu dans ces images, les îlots ont généralement une frontière rugueuse périphériques immédiatement après l'isolement. Cependant, avec le temps dans la culture, des îlots sains va acquérir et de maintenir une frontière lisse (Figure 8D). Dans certains îlots, une région centrale nécrotique va se développer,apparaissant comme une zone sombre dans le noyau. Ce centre nécrotique est souvent expulsés de l'îlot que capturé par imagerie time-lapse (Vidéo complémentaires 1). Les îlots restants apparaissent creux au centre (données non présentées) et probablement pas fonctionnel. Ainsi, nous excluons les îlots avec centre foncé pendant le processus de la cueillette à la main. Surtout, nous avons constaté que d'une incubation à basse température en suivant la procédure d'isolement (étape 4.2) peut réduire considérablement le nombre d'îlots qui développera une nécrose centrale dans la culture au fil du temps. Dans la procédure de transplantation d'îlots, deux étapes sont essentielles: l'induction chimique de diabète et de la livraison des îlots pour le rein sous-capsule région. Pour l'induction du diabète, l'objectif est de parvenir à hyperglycémique chez plus de 90% des souris injectées par STZ. Ces souris va survivre sans transplantation pendant plusieurs semaines. La dose optimale de STZ pour atteindre cet objectif varie selon les souches de souris et de l'âge, et devrait être déterminée par expérimentation. Nous avons constaté que la différence aussi petite que 20mg/kg de poids corporel peut faire une grande différence. Ainsi, un titrage avec des intervalles étroits devraient être effectuées. Pour la transplantation d'îlots, une considération clé est le modèle, qui peut avoir quatre contextes immunologiques: syngéniques, allogéniques, syngéniques auto-immunes, et allogéniques auto-immunes. Dans le modèle syngénique, la souche donneuse est le même que la souche receveuse. Ainsi, les îlots ne serait pas invoquer la réponse adaptative-immunes auprès des bénéficiaires. Cela permet aux chercheurs d'étudier les questions entourant «primaire de non-fonctionnement", un terme faisant référence à l'îlot dysfonctionnement et la perte due à des raisons autres que le rejet immunitaire spécifique par les bénéficiaires. Primaire de non-fonctionnement est pensé pour être la principale raison de l'échec des îlots à l'étape de la transplantation précoce et de l'exigence d'un grand nombre d'îlots (≥ 2 pancréas / patient) pour atteindre euglycémie. Ainsi, il est une question critique pour la transplantation d'îlots. Dans ce modèle, une masse îlot marginal qui ne rétablit pas complètement normoglycémie doit être utilisé et la souris doivent être examinés pour la glycémie à un stade précoce après la greffe, habituellement entre 1 à POD POD 7. Dans notre expérience, une masse marginale d'îlots est typiquement comprise entre 150 et 250 en moyenne par 20 îlots de taille bénéficiaires gramme en utilisant la souche C57BL / 6 de la souris. Avec le modèle syngénique, on peut utiliser génétiquement modifiés ou pharmacologiquement îlots de tester si une modulation particulière affecte l'efficacité thérapeutique des îlots au stade précoce après la transplantation. Dans les modèles allogéniques et auto-immunes, les greffes d'îlots sont exposés à une attaque immunitaire spécifique de l'hôte-immunité adaptative, qui implique les lymphocytes T, les lymphocytes B, et d'autres cellules immunitaires. Adaptive-immunité est une réponse immunitaire différée; pour doser cette réponse, il est nécessaire de transplanter un certain nombre d'îlots de saturer qui restaure efficacement normoglycémie au stade précoce après la transplantation afin de minimiser l'impact de l'enseignement primaire de non-fonctionnement. On peut alors contrôler la durée de temps avant que les îlots sont rejetés comme indiqué par la perte de la normoglycémie pour déterminer les effets de toute modification des îlots sur le rejet du greffon. Dans notre expérience, plus de 300 îlots sont nécessaires pour 20 grammes et la souris 15 à 21 jours sont le temps de rejet pour une greffe allogénique en utilisant des souris Balb / c (H-2 d) en tant que donateurs et C57BL / 6 (H-2 b) en tant que destinataires. Figure 1. Localisation de l'ouverture du duodénum du canal cholédoque. Endogènes enzymes digestives drainage du foie, le pancréas et la vésicule biliaire passer par le canal cholédoque avant d'entrer dans le tractus intestinal au niveau du duodénum. La direction de l'écoulement à travers ce conduit peut être renversée si la pression est appliquée au système par l'ajout de liquide externe. Cela se traduira par le pancréas devient plein et distendu. Figure 2. Serrage à l'ouverture du duodénum du canal cholédoque. Afin de combler le pancréas avec Libérase, il est nécessaire de bloquer l'ouverture du duodénum du canal cholédoque. Si ce n'est pas réalisé correctement, Libérase va remplir les intestins, au lieu du pancréas. Figure 3. Repositionnement du foie contre le diaphragme permet la visualisation de la région proximale du canal cholédoque. Canulation du canal cholédoque peut être réalisé le plus de succès, si elle est tenté près de son extrémité proximale (à la confluence forme de V décrit dans 2.3.1). Figure 4. Cannulating le canal cholédoque par le libre »main »méthode. A la confluence de la voie biliaire commune devient visible lorsque la pince hémostatique qui est serrée sur le duodénum est tiré vers l'extrémité postérieure de la souris. Canulation conduit peut être réalisé en plaçant l'aiguille de calibre 27, à ce confluent et la conduite à travers elle. Figure 5. Cannulating le canal cholédoque par la «pince assister» méthode. Comme mentionné dans le texte, parfois le tissu aponévrotique entourant le conduit, il est difficile de cathétériser. (A) Dans ces cas, il est utile pour dégager la couche du visage avec l'aiguille de calibre 27. (B) Le canal peut alors être clairement visualisées et soutenu par une paire de pince le bras plié. (C) Utilisation de la pince comme un filet de sécurité, l'aiguille de calibre 27 peut être introduite dans le conduit pour la livraison de Libérase. Figure 6. Même l'expansion du pancréas indique placement de l'aiguille optimale. Compte tenu de la nature translucide de la gaine et les tissus environnants aponévrotique, dans certains cas, il peut sembler que le conduit a été canulées alors qu'en fait il n'a pas. Si cela se produit et que l'aiguille pénètre dans la capsule du pancréas, de la région duodénale du pancréas commencera à étendre la livraison de la Libérase. Cependant, tout le pancréas ne sera pas perfusé et cela se traduira par des rendements faibles îlot. Pour éviter ce problème, regarder, même pour l'expansion du pancréas en particulier la recherche de signes d'enzyme entrant dans la région du pancréas fixé à la partie antérieure de l'estomac. Figure 7. Retrait du pancréas perfusé. Pour enlever le pancréas de la souris, plusieurs points de contact avec les viscères doivent être brisées. (AB) Séparer le pancréas par les intestins. (C) Séparez le pancréas de l'estomac. (D) séparer le pancréas par les intestins. (EF) Couper tous les contacts restants avec la cavité péritonéale. Figure 8. Images représentant des îlots. La pureté relative et la qualité des îlots peut être estimée au microscope à l'issue de la procédure d'isolement. (A) Si le but est de purifier les îlots du pancréas, les cellules exocrines et les débris sont parfois présents. (B) Le stress de l'isolement des îlots peut induire la mort cellulaire qui se manifeste aussi sombre régions centrales de la mue des îlots et des cellules de la périphérie des îlots. (C) Lors de la cueillette des îlots pour une expérience, éviter de capter les cellules exocrines contaminantes. (D) Ilots changement d'apparence avec le temps dans la culture. Comme îlots de récupérer de l'isolement, ils acquièrent une surface lisse périphérique. Parfois dans les grands îlots d'une région centrale foncée est visible. Ces cellules positives pour tache de la mort cellulaire. Microscopie laps vidéo supplémentaires 1. Temps de post-isolement des îlots. Dans cette vidéo laps de temps 16 h les îlots peut être vu le développement de centres nécrotiques qui sont finalement éjecté. S'il vous plaît cliquez ici pour la vidéo .