Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

1. Preparazione e calibrazione di Reagente Liberase Questo protocollo utilizza Liberase TL (Roche, Cat # 05 401 020 001) per la digestione degli enzimi pancreatici. Acquisto di 100-200mg alla volta e fare una grande serie. Risospendere polvere liofilizzata sterile in acqua di grado HPLC modo che la concentrazione è di circa 26 unità Wünsch per ml. Questo dovrebbe essere di circa 5 mg / ml. Vedere il foglietto illustrativo per i dettagli sulle unità Wünsch contenute nel lotto specifico. Luogo fiale in ghiaccio per 30 minuti con gentile vorticoso ogni pochi minuti. Verificare polvere sia completamente sciolta alla fine di 30 minuti. Piscina tutti Liberase disciolti insieme e mescolare con vorticoso dolce (NON vortex o agitare). Aliquota 24,3 unità Wünsch di provette precedentemente congelate Eppendorph, congelamento rapido in azoto liquido (trattarlo come qualsiasi enzimi) e conservare a -80 ° C. Questo dovrebbe essere di circa 0.935ml per tubo Eppendorph. Ciascuna aliquota è per uso singolo (sufficiente per 11 topi) e non devono essere conservati o ricongelati una volta scongelati. In generale, il titolo è stabile per almeno 6 mesi. Per ogni nuova partita, calibrare il tempo ottimale di incubazione. Utilizzare lo stock congelati, non lo stock appena sciolto, per la taratura, per simulare le reali condizioni sperimentali il più possibile. Calibrare il bagno d'acqua che si intende utilizzare per esattamente 37 ° C con un termometro a mercurio. Utilizzare lo stesso incubatore in futuri esperimenti. Prima dell'uso, scongelare un tubo di Liberase su ghiaccio e aggiungerla (0.935ml) per 21.6ml siero libero RPMI, rendendo la concentrazione finale di lavoro Wünsch 1,08 unità per ml. Siero, BAS ed EDTA inibire Liberase. Zinco e calcio sono cofattori. Negozio su ghiaccio e l'uso di 1,5 ore. Questo è sufficiente per circa 11 topi (2ml/mouse). Vedere il punto 2.3 per perfusione pancreas. Profumato come topi numero possibile di 1 ora. Quindi utilizzare uno o due topi per ogni tempo di incubazione e di prova 10, 12, 14, 16, 18 minuti i tempi di incubazione. Se possibile, includere intervalli di 30 secondi tra i tempi come i tempi di digestione è molto importante. Completa il protocollo isolotto isolamento e analizzare resa isolotto e la qualità da ogni punto di tempo di incubazione. In definitiva, la resa non dovrebbe cambiare troppo tra le ore di punta, ma la qualità di isolotti a quegli intervalli possono variare. Per gli esperimenti successivi, usare le condizioni che determinano il maggior numero di isole che sono sani 48 ore dopo isolamento. L'età dei topi sembra influenzare il tempo ottimale di incubazione. Quindi, usare i topi all'interno di una fascia di età simile. Idealmente, usare 8-12 topi settimana di vita, ma anche i topi 8-10 mesi può produrre buoni isolotti. Per la calibrazione, utilizzare più giovani topi. 2. Procedura chirurgica Preparate tutte le attrezzature e mezzi di comunicazione prima di eutanasia i topi donatore isolotto. Autoclave o fiamma sterilizzare gli strumenti prima dell'uso. Tutti i reagenti e strumenti (toccando i campioni) devono essere sterili. L'isolamento e la raccolta manuale delle isole può essere eseguita al di fuori di una cappa a flusso laminare senza aumentare di molto l'incidenza di contaminazione. Tuttavia, la sterilizzazione di strumenti che entrano in contatto con pancreas o isole è fondamentale per evitare contaminazioni. Gli strumenti sono necessari: 1 paio di forbici per dissezione incisione addominale. 2 paia di pinze. 1 pinza emostatica per bloccare fuori il dotto biliare. 0,419 millimetri di diametro rete metallica. 0,1 millimetri di diametro mesh di nylon. Piegare alcuni aghi calibro 27 in modo che un angolo di 70 gradi è introdotto circa a metà della lunghezza dell'ago. Il bordo smussato dell'ago deve essere rivolta la parte interna del gomito. Riempire un flacone spray con il 70% di etanolo. Impostare un microscopio da dissezione con una fonte di luce adeguata su una panchina di laboratorio o in un cappuccio. Pre-chill centrifuga a 4 ° C. Centrifuga deve avere un rotore a battente, essere in grado di 900xG, essere refrigerati, e fare una pausa che può essere disinserito. Su un Sorvall RT6000D con il H1000B Sorvall rotore, una velocità 900xG è 2400rpm. Più lento spin sono fatto a 800 giri. Posizionare i seguenti reagenti sul ghiaccio. RPMI (1 litro con 10% siero) RPMI (200ml senza siero) Provette coniche da 50 ml (1 per ogni pancreas) Siringa da 5 ml. Equilibrare Histopaque1077 nella stanza temratura. Scongelare un'aliquota singolo utilizzo di Liberase calibrato su ghiaccio e diluire nel 22.5ml siero libero RPMI. Siero, BAS ed EDTA inibire Liberase. Zinco e calcio sono cofattori. Negozio su ghiaccio e l'uso di 1,5 ore. Questo è sufficiente per circa 11 topi (2ml/mouse). Calda a 37 ° C acqua sporca. Avere a portata di mano come topi che puoi cannulate in 1 ora (circa 10-18 topi). Preparare il mouse per incannulazione. In primo luogo l'eutanasia il mouse dislocazione cervicale o CO 2 asfissia. Mentre il mouse è in scadenza, riempire la siringa da 5 ml con 2 ml magazzino Liberase di lavoro (1,08 unità Wünsch / ml). Del mouse posto in posizione supina su un tovagliolo di carta a portata dissezione e spruzzare l'addome con il 70% di etanolo prima di aprire il suo addome con un V-incisione della regione pubica ad entrambe le zampe anteriori. Pliche cutanee sul torace per rivelare la cavità addominale. Posizionare il mouse con la testa rivolta verso di voi. Individuare la voce duodenale del dotto biliare comune come evidenziato nella FIG.1. Questo può essere fatto senza guardare attraverso oggettiva portata dissezione. Morsetto l'apertura duodenale con hemostat come dimostrato in FIG.2. Posizione del fermo è fondamentale per bloccare il flusso di Liberase negli intestini. Se la pinza è troppo alta o troppo bassa, Liberase non profumato al pancreas. Hemostat posizione, in modo che quando compressi, corre esattamente lungo il pancreas / intestino confine. Prima cannulating il dotto biliare comune, può essere necessario riposizionare il fegato premendolo contro il diaframma, in modo che l'intera lunghezza del dotto biliare comune è esposto (fig.3). Una volta che la lunghezza del condotto biliare esposte, utilizzare il piegato gague 27-ago attaccato alla siringa Liberase riempito per incannulazione. Ci sono due tecniche per cannulating il dotto biliare. Nella prima tecnica, o un metodo 'mano libera', il emostato bloccato sul duodeno è tirato fuori dalla testa del mouse verso la coda in modo che il dotto biliare comune diventa teso. C'è una confluenza nel dotto biliare vicino al fegato, dove la bile drenaggio dalla cistifellea e gli enzimi del fegato si riuniscono prima di entrare l'intestino. L'interno della V formata da questa confluenza è esposto tirando il dotto biliare e stretto è il luogo ideale per iniziare incannulazione del dotto (fig.4). Se posizionato correttamente, l'ago scivolerà a destra attraverso il V, e direttamente cannulate la parte inferiore della condotta. Inserire l'ago alcuni millimetri nel condotto prima di dispensare il Liberase. Posizionamento dell'ago ottimale è importante per impedire il riflusso nel fegato e della cistifellea. Inoltre, è importante che l'ago non è inserito finora che ostruisce il condotto splenica. Il condotto della milza è un difficile vedere ramo del dotto biliare comune e drena la coda splenica del pancreas, in una zona isolotto ricco. Se l'ago scivola passato l'apertura per il condotto splenica, ci saranno meno di perfusione completa della coda della milza e la digestione potenzialmente ridotti di questa zona. Isolotto resa ottimale si verifica quando la profondità ago è abbastanza lontano che non Liberase sfugge al fegato / cistifellea, ma non così lontano che hai superato il condotto splenica. È possibile verificare per incannulazione successo dispensando una piccola quantità di Liberase. Se vedi il Liberase riempimento del condotto poi dispensare il resto del 2mls. Se l'area intorno al condotto comincia a riempirsi, per arrestare l'erogazione, riposizionare l'ago, e riprova. Nella seconda tecnica, o 'pinze assistere' metodo, il emostato bloccato sul duodeno è tirato fuori dalla testa del mouse verso la coda in modo che il dotto biliare comune diventa teso. Quindi, utilizzando il piegato gague 27-ago attaccato alla siringa da 5 ml, forare la fascia al di sotto del dotto biliare comune vicino al fegato. Utilizzare l'ago per eliminare la fascia dal condotto (fig. 5). Con l'ago ancora nel luogo, impostare il emostato verso il basso e prendere un paio di pinze. Utilizzare un braccio della pinza aperta a sollevare il dotto biliare, dove l'ago ha autorizzato la fascia. Le creste del forcipe creare un tratto che è possibile utilizzare per guidare l'ago nel canale. Mentre si tira il condotto e pinze verso di voi, far scorrere l'ago nel condotto utilizzando le pinze come un fermo. Test per incannulazione dispensando una piccola quantità di Liberase. Se il canale comincia a riempirsi (FIG.5 Arrow), dispensare il resto della 2mls. Se l'area intorno al condotto comincia a riempirsi, per arrestare l'erogazione, riposizionare l'ago e riprovare. Come 2mls di Liberase riempie il pancreas, l'area vicino al duodeno comincia ad espandersi per primo, seguito dalla regione sulla parte superiore dello stomaco, e, infine, la coda della milza (Fig. 6). Cercate anche l'espansione del pancreas (FIG.6). Se una zona comincia ad espandersi e non vedete il tessuto bianco in modo uniforme l'espansione e la diffusione fuori, è probabile che il dotto biliare comune non è stata cannulata, ma l'ago è all'interno della capsula pancreatica. Riempire la capsula con Liberase non si tradurrà in un isolotto alto rendimento come la superficie esposta al enzima sarà basso. In questo caso, interrompere la perfusione e riposizionare l'ago. Una volta che il pancreas è stato perfuso, può essere rimosso dal mouse tirandolo libero dai punti di contatto con l'intestino, lo stomaco e la milza. Cominciare rimuovendo il hemostat dal duodeno. Quindi, usare il forcipe per sollevare il duodeno e il pancreas separato dagli intestini con un secondo paio di pinze (FIG.7A-B). Questo viene fatto tenendo la seconda coppia di pinze costante mentre si estrae l'intestino fuori dell'addome. Quindi, tirare il pancreas libera dalla parte superiore dello stomaco e la milza (FIG.7C-D). Infine, sollevare il pancreas fuori dell'addome e tagliarlo libero dalle connessioni fascia rimanenti (FIG.7E-F). Posizionare il pancreas in un tubo da 50 ml conica e lasciarlo sul ghiaccio mentre si lavora su altri topi. Avviare un timer 1 ora. Per la resa massima isolotto, posto a solo 1 pancreas in ciascun tubo. Si raccomanda di non lasciare il pancreas perfuso in ghiaccio per più di 1 ora, in quanto il Liberase inizierà a degradare il tessuto. Alla fine dell'ora, prontamente passare al punto 3.0 per tutti i pancreas che sono stati perfusi. Ripetere i passaggi 2,3-2,6 per i topi rimanenti o fino a quando il timer 1 ora nel passaggio 2.6 è scaduto. 3. Isolotti purificare dal pancreas perfuso Prima che le isole può essere purificato da parte del pancreas, il tessuto deve essere digerito a 37 ° C. Gruppo 50ml tubi porta il isolotti perfuso in un rack fondo aperto che si inserisce nel bagno d'acqua a 37 ° C. Assicurarsi che tutti i tappi siano ben protetti e tubi immergere nel bagno d'acqua a 37 ° C per la quantità esatta di tempo predeterminato per il batch corrente di Liberase (Vedere il punto 1.4). Al termine dell'incubazione, spostare i tubi di ghiaccio e aggiungere RPMI1640 con il 10% di siero di 20mls per provetta. Siero supporti contenenti fermerà la digestione Liberase. Dissociare il tessuto agitando vigorosamente le provette 40 volte in 10 secondi. Questo passaggio è fondamentale per il recupero ottimale di isolotti. Anche con perfusione Liberase ottimali e tempo di digestione strettamente calibrata, resa isolotto sarà bassa se il tessuto non è spezzato. Il trattamento aggressivo dei campioni in questa fase non sembra danneggiare gli isolotti del mouse ed è necessaria per liberarli da gruppi di cellule esocrine. Per separare le isole dal pancreas digerito, completare i seguenti passaggi. Piscina digerito pancreas in modo che ci siano circa 2,5 pancreas per provetta. In tal modo, dieci tubi sarà condensato a 4 tubi con 50mls di media ciascuno. Centrifugare i tubi per 2 minuti a 800 giri e 4 ° C. Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in 15-25mls media con 10% FBS delicatamente con il vortex (vortice regolare l'intensità a circa il 50% del massimo) per alcuni secondi. Versare l'impasto risospeso attraverso la rete metallica 0,419 millimetri e imbuto in una fresca 50ml tubo conico. Questo separa il tessuto non digerito, il grasso e la linfa. Sciacquare il tubo iniziale con un 10mls aggiuntivo di supporto contenente 10% FBS e versare attraverso la rete metallica. Ripetere la procedura per i tubi rimanenti. Centrifugare le provette per 2 minuti a 800 giri e 4 ° C. Eliminare il sopranatante e con attenzione invertire i tubi su un tovagliolo di carta. Guardare per assicurarsi che le isole non scivolare. Pulire l'interno dei tubi con un tovagliolo di carta per rimuovere i media residua, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Ritorna tubi in posizione verticale. Risospendere il pellet in 5mls della temperatura ambiente histopaque1077 vortexando delicatamente per alcuni secondi. Assicurarsi che la sospensione sia omogeneo prima di aggiungere un ulteriore 5mls HISTOPAQUE circa l'interno del tubo. Questa lava le isolette al largo della parete del tubo. Sovrapposizione HISTOPAQUE con 10mls di siero libero RPMI, facendo attenzione a mantenere una interfaccia netta tra le HISTOPAQUE e media. Aggiungere i media pipettando lentamente lungo il lato del tubo ad una velocità di 1 ml per 10 secondi. I media dovrebbero essere in cima, e HISTOPAQUE sul fondo. Siero influisce sulla densità dei mezzi di comunicazione e non deve essere usato durante questo passaggio. Spin campioni in una centrifuga equilibrati a 20 ° C a 2400rpm (900xG) per 20 minuti con accelerazione molto lenta e senza freno. Questo passo separa le isolette dalle cellule esocrine. Gli isolotti migrerà l'interfaccia tra i media liberi e siero HISTOPAQUE mentre le cellule esocrine will forma una pallina sul fondo della provetta. Raccogliere le isolette dal HISTOPAQUE / media interfaccia con una pipetta 10 ml monouso sierologici. Isolotti che si attacchi al vetro, quindi pipette di vetro non devono essere utilizzati se non sono stati siliconata. Luogo isolotti in una fresca 50ml tubo conico. Diversi tubi possono essere raggruppati a questo punto. Riempire i tubi per 50 ml di siero contenente RPMI. Centrifugare i tubi per 2 minuti a 800 giri e 4 ° C. Eliminare il sopranatante e risospendere il isolotti 50mls di siero RPMI contenente vortexando delicatamente. Centrifugare le provette per 90 secondi a 800 giri e 4 ° C. Eliminare il sopranatante e ripetere il tempo di lavaggio altri 1. Eliminare il sopranatante e prendere i tubi per il cofano coltura dei tessuti. Aggiungi pen / strep di RPMI contenente 10% FBS ad una concentrazione finale di 1% per rendere i terreni di coltura isolotto. Risospendere le isolette in 5mls di questo mezzo di coltura. Invertire una cella di 0,1 millimetri filtro di nylon e posizionarlo su un tubo 15ml conica. Lentamente passare il liquame risospeso isolotto attraverso il filtro. Gli isolotti sarà trattenuto dal filtro mentre le cellule esocrine passano attraverso la colonna 15ml conica. Questo passo aumenta notevolmente la purezza delle isole quanto riguarda la contaminazione delle cellule esocrine alla fine del protocollo. Sciacquare il tubo da 50 ml conica con un 6mls aggiuntivo di media e pipetta attraverso il filtro. 3mls luogo di media cultura come un forte calo di 10 cm capsula di Petri. Invertire il filtro lato destro del cellulare, in modo che la superficie utilizzata per catturare le isole possono essere immerso nel drop per i media. Toccando il filtro per i media trasferire la maggior parte delle isole in un non-tessuto coltura trattata capsula di Petri. Utilizzando un non-trattati Petri è fondamentale per evitare l'adesione delle isole e la dispersione verso la superficie della piastra. Libero isolotti galleggianti sono molto più facilmente raccolti per la separazione in gruppi sperimentali. Pipettare un ulteriore 5-7mls dei terreni di coltura attraverso il filtro nella piastra di Petri di lavare ogni residuo isolotti al largo del filtro nel piatto. Controllare la resa e la qualità isolotto con un obiettivo 4x su un microscopio invertito. Agitando il piatto in un ovale stretto raccoglierà gli isolotti al centro del piatto. Se gli isolotti guardare bene, possono essere raccolti immediatamente per uso sperimentale o separati in modo uniforme tra le piastre di Petri 4-6 10 centimetri (per 10 topi). Isolotti coltura troppi nello stesso piatto fa sì che il isolotti a diventare necrotiche e degradare. Per gli esperimenti, 250-300 isolotti sei centimetri per ogni piatto con 2-3mls dei media non sembra sottolineare l'isolotti. Ci saranno alcuni isolotti utilizzabile nel tubo 15ml conica che ha raccolto il 0,1 millimetri cella di flusso attraverso il filtro di nylon. Queste isole possono essere recuperati in seguito a 3-4 giri di sedimentazione gravità. Dopo circa 4 minuti di sedimentazione, aspirare tutti, ma circa 1ml di supporto dal tubo e ricarica al top con terreni di coltura. Chiudere la provetta e miscelare. Ripetendo questo processo più volte elimina molte delle singole cellule esocrine cella che sono lenti a sedimenti, e arricchisce la più pesante aggregati di cellule endocrine (isolotti) che rapidamente affondare. Dopo l'aspirazione finale, risospendere in 7mls dei terreni di coltura e la piastra in una capsula di Petri fresca. 4. Lavorare con i gruppetti isolati Il processo di isolamento è abbastanza stressante per le isole; HISTOPAQUE è tossico, agitazione e le fasi di centrifugazione indurre stress pura, e la rimozione dalla rete ospite di sangue così come in coltura in vitro possono indurre ipossia. Noi e altri hanno mostrato che l'isolamento induce la morte delle cellule beta 4-5. L'effetto di queste sollecitazioni è visto dalla desquamazione delle cellule dalla periferia dell'isolotto e l'oscuramento e l'espulsione del nucleo centrale dell'isolotto (necrosi centrale). Mentre la desquamazione delle cellule dalla periferia può essere tollerata, la necrosi centrale dell'isolotto lo squalifica per l'utilizzo negli esperimenti. In genere, maggiore è il isolotto, maggiore è la possibilità che necrosi centrale sarà un problema. Sforzi volti a ridurre l'isolotto di isolamento risposta stress post aumenterà la resa di isolotti utilizzabile. Pertanto, si usa una tecnica riportato in precedenza di incubazione le isole in un 22-27 · cultura incubatore tessuto C per le prime 48-72 ore seguenti l'isolamento 6-8. Questa temperatura ridotta attenua lo stress isolotti risposta e leviga il loro passaggio alla coltura in vitro. Se un 22-27 ° C di coltura tissutale incubatore non è disponibile, è possibile raggiungere la temperatura desiderata in una cultura incubatore standard di tessuto disattivando il controllo del calore e l'immissione di circa 20 £mattoni congelatore equilibrati a -80 ° C. Ciò si traduce in circa 16-24 ore di temperatura ridotta in incubatrice. Sostituire l'° -80 mattoni congelatore C, se necessario. Non abbiamo osservato un ulteriore beneficio da questo di incubazione a temperatura inferiore più lungo di 72 ore. In aggiunta alla bassa temperatura di incubazione, si consiglia di sostituire i mezzi di 24-48 ore dopo l'isolamento. Fattori secreti da isolotti sottolineato e morti si accumulano nell'isolamento seguenti mezzi e possono promuovere ulteriore stress isolotto. Per cambiare il supporto, completare la seguente procedura. Trasferire i media e isolotti dalle capsula di Petri di un tubo da 15 ml conica con una pipetta di plastica. Lavare la piastra con un 3mls aggiuntivo di terreni di coltura per raccogliere isolotti residuo. Aggiungi questo 3mls aggiuntivo per il tubo 15 ml conica e consentire isolotti di sedimento gravità per 5min. Aspirare tutti ma 1ml di supporto dal tubo 15ml conica, poi risospendere il isolotti 4mls dei terreni di coltura isolotto. Trasferire il isolotti e media per un piatto fresco di Petri. Aggiungi un 3mls aggiuntivo di terreni di coltura per il tubo 15 ml conica per raccogliere qualsiasi residuo di isolotti e aggiungere questo alla piastra di Petri. Cambiare il supporto isolotto ogni 3-5 giorni successivi. Al momento del ritiro isolotti per un esperimento, non è consigliabile mescolare isolotti da isolamenti diversi. La linea di base molecolare delle isole è influenzato da molte cose, tra cui la quantità di tempo che sono stati nella cultura e lo stress isolamento che variano da preparazione a preparazione. Per ridurre la variabilità, gli esperimenti isolotto deve essere eseguita su isolotti che sono stati isolati, allo stesso tempo. Tuttavia, se ciò non fosse possibile, consigliamo vivamente di mettere in comune tutte le isole in un unico gruppo prima della loro raccolta per gli esperimenti. Per scegliere isolotti per gli esperimenti, completare la seguente procedura. Se isolotti sono incubando in più di un piatto, piscina per tutte le isole in un piatto unico, seguendo i passi da 4.3.1 4.3.5 di cui sopra. Se più piatti di isolotti sono coinvolti, un tubo da 50 ml conica deve essere usato al posto del tubo 15ml. Ciò può ridurre la variabilità indotta da sottili differenze nelle condizioni di cultura tra le piastre durante il post-isolamento periodo di recupero. Durante sedimenti gravità delle isole, istituito un microscopio rovesciato dotato di un obiettivo 4x o 10x. Raccogliere una micropipetta P200 e una scatola di punte sterili p200. Trasferire il isolotti sedimentati su una singola lastra e spostare la piastra al microscopio. Agitare il piatto per raccogliere le isolette al centro. Togliere il coperchio alla piastra e usare il p200 pipetta di scegliere isolotti in buona salute. Isolotti sani hanno confini liscia e non le regioni centro scuro (Figura 8). Cercare di mantenere una distribuzione uniforme di dimensioni isolotto tutto piatti sperimentali come la dimensione isolotto possono alterare la risposta al trattamento. Il numero di isolotti per gruppo sperimentale può variare in base alle esigenze dell'esperimento. Si stima che un isolotto ha circa 1000-2000 cellule e produrrà 0,3 1μg 25ng di proteine ​​e di RNA totale. Per i test in vitro, un gruppo sperimentale tipico può essere compreso tra 100 e 250 isolotti placcato in 35mm o sei centimetri piatti con 1-3ml di media. Per il trapianto, ogni mouse destinatario richiederà tra i 150 e 400 isolotti a seconda del disegno sperimentale (vedere il punto 5.2.2 e di discussione per maggiori dettagli). Per ridurre al minimo le variazioni introdotte dal processo di raccolta a mano, si usa l'orifizio del P200-puntale come guida per la stima dimensioni isolotto. La maggior parte delle isole hanno un diametro circa la metà del diametro del foro, e contiamo ciascuno di loro come un isolotto di serie. Qualsiasi isolotti più grande o più piccola di quella, verrà assegnato un numero diverso isolotto di conseguenza. Raccogliamo isolotti in lotti di 20-50 e trasferirli ai piatti designato sperimentale. Se il P200-pipetta è impostato al volume di 180 microlitri, si può raccogliere isolotti più (in genere più di 50 isolotti) in una sola punta. Così, anche se le isole sono raccolti uno alla volta, si possono raccogliere molte isolette all'interno di ogni P200-punta controllando il meccanismo di rilascio Pipetman. Questo facilita la raccolta di centinaia o anche più di un migliaio di isolette necessari per gli esperimenti. Usiamo anche questa partita-saggia operazione di aiutare anche la distribuzione di isolotti con qualità e dimensioni simili. 5. Sottocapsulare renale Islet Transplantation Indurre il diabete nei topi riceventi trapianto. Topi posto su un veloce 4-6 ore. Trapiantati ottimale dovrebbe essere tra i 6 ei 10 settimane e pesano 20-25 grammi al momento della veloce. Di digiunare i topi, togliere il cibo dalla feeding rack e sempre posto i topi in una gabbia fresca. Questo assicura un vero digiuno, separando i topi da ogni bit residui di cibo che possono avere già caduti nelle loro gabbia. Piano per l'80% al 90% dei topi di diventare diabetici. Tre ore nel veloce, preparare il tampone di citrato di sodio. Pesare 0.735g di enzima citrato di sodio grado (Na citrato, il signor 294,10 g / mol) e si dissolvono in 25mls di acqua deionizzata sterile. Regolare il pH a 4,5 con HCl. Questo buffer dovrebbero essere freschi per ogni turno di esperimenti. Luogo 0,05 g streptozotocina (STZ, M r 265,2 g / mol) in una provetta 1,5 ml Eppendorph. Tale importo è sufficiente per indurre il diabete in circa 8 topi. Preparare un numero adeguato di tubi 1,5 ml per il numero di topi da iniettare. STZ è sensibile alla luce, in modo da coprire ogni tubo con un foglio di alluminio. Dopo 4 ore di digiuno, risospendere un tubo di STZ con 1 ml di Na citrato appena fatto tampone. Una volta risospeso, la STZ-Na soluzione di citrato perde l'attività entro 15 a 20 minuti, quindi questo passo deve essere fatto immediatamente prima di iniettare i topi. Iniettare ciascuna intraperitoneale topo con un volume adeguato di STZ-Na Citrato soluzione per ottenere una dose finale di 190mg/kg mouse. Questa dose può variare a seconda del ceppo e l'età del mouse, quindi potrebbe essere necessario eseguire una ottimizzazione della dose se l'incidenza del diabete è troppo bassa o se i topi troppi stanno morendo nella 3 a 5 giorni dopo l'iniezione. Dosi comunemente usati vanno da 150mg/kg mouse per il mouse 250mg/kg. Approvvigionamento di cibo e acqua una volta che tutti i topi sono stati iniettati. Topi di prova per i non-digiuno iperglicemia (> 350mg/kg) 2 a 4 giorni dopo l'iniezione. I topi che dimostrano di 3 giorni consecutivi non a digiuno iperglicemia può essere utilizzato come trapiantati. Preparare isolotti per il trapianto Isolare isolotti come sopra descritto ai punti 2.0 e 4.0. Se necessario, isolotti può essere isolato il giorno del trapianto o prima. Scegli isolotti in gruppi per i trapianti mettendoli in tubi sterili Eppendorph 1,5 ml. Sì che le tubature su ghiaccio. Il numero di isolotti necessari per ripristinare la normoglicemia possono variare, date le condizioni dell'esperimento (ceppo donatore isolotto, il peso e la tensione del destinatario, ed eventuali trattamenti aggiuntivi fornita al beneficiario) e la persona che sta prendendo le isolette. La dimensione del mouse destinatario è una variabile importante che influenza il numero minimo delle isole, come i topi grandi richiederanno più isolotti. Siamo costantemente scoprire che 150-250 isolotti solo marginalmente ripristina normoglicemia mentre 300 isolette o più è curativo in un 18 a 20gram C57BL / 6 del mouse destinatario. In questi esperimenti, i topi donatore isolotto erano o C57BL / 6 o Balb / c. Isolotti trapianto di rene sacchetto sottocapsulare Montare i seguenti materiali (tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati): Tabella 1. Attrezzature per il trapianto 25μl Hamilton siringa 6 "del PE 50 tubi flessibili in modo da ridurre da un lato è smussato Gel di carico e p200 puntali Sterili Eppendorph tubi (1 per destinatario) Vaporizzatore isoflurano e isoflurano Eppendorph tubo cremagliera McPherson-Vännäs Forbici (1) Pinze braccio piegato (2) Hemostats (1) Clip ferita con clip 27 gauge Fiamma tirato sonde tubo capillare di vetro * Cotone con punta applicatori 50ml tubo conico della PBS sterile Suture Cesoie elettriche Etanolo al 70% flacone spray Penna a sfera Betadine chiaro telo di plastica sterile * Nota: Nella preparazione di questi sonde, tentativo di creare un arco nella sonda che imita l'angolo del rene mouse. Inoltre, assicurarsi che l'estremità della sonda è adeguatamente fiammato lucidato in modo che non esistono spigoli vivi. Pesare e tag di tutti i topi riceventi diabetici. Assegnare ogni mouse per un gruppo sperimentale prima del trapianto in modo che ogni gruppo ha allo stesso modo corrispondente peso corporeo. Impostare un campo chirurgico all'interno di un cofano anteriore attrezzato con l'uscita del gas dal vaporizzatore isoflurano. Anestetizzare un mouse destinatario con isoflurano e poi la barba suo fianco con le cesoie elettriche. Shave il mouse al di fuori della zona in cui i trapianti saranno eseguiti. Ritorna mouse per anestesia e posizionarlo perpendicolare mentire e di essere direttamente sopra l'albero di una bacchetta di vetro in modo che il fianco rasata rivolto verso l'alto. Fianco a spruzzo con il 70% di etanolo. Il mouse deve essere preparata con uno scrub chirurgico di alternare betadine e alcol ripetuta tre volte. Far passare il mouse con telino sterile trasparente che permette l'accesso al fianco rasata. Preparare le isole per il trapianto mentre il mouse viene anestetizzata. Per fare ciò, la procedura seguente. Inserire una punta sterile carico gel nella apertura di un tubo di 1,5 ml Eppendorph modo che ci sia una curva dolce che fa una forma di U, alla fine, stretta della punta. L'apertura della punta deve essere rivolto direttamente fuori dal tubo Eppendorph. Non introdurre un nodo in qualsiasi punto della punta di carico gel come questo si tradurrà nel taglio delle isole e una riduzione del numero di isolotti che si trapiantano. Rimuovere delicatamente dal ghiaccio un tubo di isolotti che è stata preparata in fase 5.2.2. Tutte le isole dovrebbero essere risolte sul fondo della provetta. Usando una pipetta P200, delicatamente raccogliere le isole in un volume minimo dal fondo della provetta. Trasferimento di questi isolotti attraverso l'apertura di grandi dimensioni della punta di carico gel preparato al passo 5.3.6.1. Gli isolotti dovrebbe stabilirsi nella lunghezza stretti stretti o limitazione della punta di carico gel. Dopo gli isolotti hanno sedimentato, come rimuovere gran parte dei media dalla punta gel di carico possibile. Questo può essere realizzato utilizzando una nuova punta di carico gel attaccato ad una pipetta P200 aspirando il supporto attraverso l'ampia apertura delle isole pancreatiche cuscinetto gel punta di carico. Trasferire il isolotti sedimentate nel tubo PE 50 flessibile (~ 15 centimetri di lunghezza). Questo può essere fatto in primo luogo allegando la non smussato all'estremità del tubo per la stretta apertura della isolotto-cuscinetto punta di caricamento del gel prima di fissare la punta di una pipetta P200. Le isole possono poi essere spinta attraverso il 60% della lunghezza del tubo. Trasferire il cuscinetto isolotto PE 50 tubi ad una siringa 25μl Hamilton. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa è stato ritirato prima di trasferire il tubo. Collegare il non smussato bordo del tubo PE 50 per l'ago della siringa. Spingere il pistone della siringa fino a quando le isole sono circa 0,5 centimetri di distanza dall'apertura smussato. La siringa da parte in modo che gli isolotti può risolvere in una sola massa vicino all'apertura smussato del tubo mentre il rene si sta preparando a ricevere le isolette. Usando le dita, localizzare il rene attraverso la pelle del mouse sotto anestesia. L'albero della penna a sfera dovrebbe essere direttamente sotto la zona dove si trova il rene e posizionato perpendicolarmente al midollo spinale. Una volta che il rene è localizzato, utilizzare il McPherson-Vännäs forbici per fare una incisione 2 centimetri attraverso il derma direttamente sopra di esso in direzione perpendicolare al midollo spinale. Questa incisione esporrà la parete peritoneale. Con la McPherson-Vännäs forbici fare una incisione 1 centimetro attraverso la parete peritoneale nella stessa direzione, come il taglio attraverso lo strato dermico. E 'importante che l'apertura creato da questa incisione essere inferiore del rene di essere esposto. Utilizzando l'albero la bacchetta di vetro come un fermo, la forza del rene attraverso l'apertura peritoneale premendo verso il basso °e superficie adiacente. Se l'apertura è leggermente più piccolo del rene, il rene si spremere attraverso l'apertura e il riposo stabilmente sulla superficie del mouse senza alcuna manipolazione o ulteriore contatto. Questa posizione è ottimale per i passi successivi trapianti. Se l'apertura è troppo grande, il rene ricadrà nella cavità peritoneale, rendendo difficile per completare i passaggi successivi. Bagnare la superficie del rene esposti con ghiaccio freddo PBS sterile utilizzando un cotone imbevuto di punta applicatore. Ripetere questa operazione ogni pochi minuti o, se necessario per evitare che la capsula del rene si secchi. Utilizzando i 27 gauge, fare una incisione 0,2 centimetri attraverso la capsula del rene attraverso la superficie anteriore del rene si spostano da sinistra laterale verso il lato destro laterale. Utilizzando la fiamma tirato sonda tubo capillare di vetro, creare una sacca tra la capsula renale e parenchima renale. Farlo inserendo la sonda attraverso l'incisione effettuata nel passaggio 5.3.12 e spostarlo in direzione posteriore lungo la superficie dorso-laterale del rene. Una sonda ideale avrà una curva in modo che corrisponda l'arco naturale di questa superficie del rene. Questo permetterà alla sonda di raggiungere il fine più posteriore del rene, senza strappi aprire una grande apertura anteriore. E 'importante fare questo sacchetto come lunga e stretta possibile. Breve sacchetti gamma non sono l'ideale in quanto consentono isolotti di fuggire dalla capsula. Sacchetti lungo e stretto permettono le isolette da depositare verso la fine posteriore del rene con una perdita minima dalla sacca capsulare. Recuperare la siringa 25μl Hamilton preparato al passo 5.3.6 e spostare gli isolotti fino al limite dell'apertura smussato del tubo flessibile. Inserire il bordo smussato del tubo flessibile nel sacchetto subcapsulari preparato al punto 5.3.13. Il bordo smussato deve essere rivolto verso l'alto, in modo che il lato lungo è in contatto con il parenchima renale. Spostare il tubo alla fine la maggior parte posteriore della capsula. Lentamente trasferire le isolette dal tubo PE 50 nel sacchetto subcapsulari premendo lo stantuffo della siringa. Come gli isolotti riempire il sacchetto lentamente il tubo flessibile fuori rendendo più spazio per le isole da depositare. Assicurarsi che tutte le isole vengono trasferiti dal tubo nel sacchetto. Non riempire la sacca di aria o liquido in eccesso. Dopo aver rimosso il tubo PE 50 dal sacchetto, utilizzare la fiamma tirato sonda tubo capillare di vetro per il confezionamento delicatamente gli isolotti nel fine prossimale della tasca. Fate questo facendo scorrere la sonda in vetro lungo la superficie esterna del rene in movimento in una direzione anteriore a posteriore. Fare attenzione a non mettere in valigia le isolette troppo stretto come la fine posteriore della borsa subcapsulari possono rompersi e rilasciare le isolette. Questa operazione riduce al minimo la perdita di isolotti dall'apertura anteriore del sacchetto quando il rene è rimessa all'interno della cavità peritoneale. Utilizzando una pinza braccio piegato sollevare il rivestimento peritoneale adiacente all'apertura fatta per il rene e quindi utilizzare un cotone imbevuto di PBS punta applicatore per spingere delicatamente indietro il rene nella cavità peritoneale. Chiudere il mouse applicando punti di sutura alla parete peritoneale e clip ferita al derma. Ritorna il mouse per la sua gabbia e ripetere i passaggi attraverso 5.3.4 5.3.19 per i topi rimanenti. I topi devono essere tenuti al caldo con una piastra elettrica sotto la gabbia o una lampada di riscaldamento con gli occhi protetti fino a quando il mouse si riprenda pienamente dall'anestesia. Gli animali devono essere dotati di acetominophine in acqua (6 mg / mL). Controllare non a digiuno i livelli di glucosio nel sangue 24 ore più tardi. Tutti i topi dovrebbero essere normoglicemici (glicemia <200mg/dl) a livello post-operazione al giorno (POD) 1. 6. Rappresentante Risultati Due principali procedure sono descritte in questo protocollo: (1) l'isolamento delle isole e (2) trapianto di isole sotto la capsula renale. Nella procedura di isolamento delle isole, i rendimenti isolotto in genere varia tra 100-150 isolotti per il mouse a seconda dell'età e la tensione. La purezza di questi isolotti rispetto alla loro separazione dalle cellule esocrine del pancreas possono variare molto tra loro preparazione. Tuttavia l'uso di Histopaque1077 temperatura ambiente al punto 3.3.7 e un filtro di nylon 0,1 millimetri nel punto 3.3.17 tipicamente consentire una maggiore purezza del 99% di isolotti. Questa purezza si ottiene prima di qualsiasi raccolta manuale aggiuntivo di isolotti. Immagini rappresentative delle isolamento isolotti seguenti sono mostrati in Figura 8D. Come si è visto in queste immagini, gli isolotti di solito hanno un bordo ruvido periferico isolamento subito dopo. Tuttavia, con il tempo di cultura, isolotti sano acquisire e mantenere un bordo liscio (Figura 8D). In alcuni isolotti, una regione centrale necrotica si svilupperà,appare come una zona scura nel nucleo. Questo centro necrotico viene spesso espulso dal isolotto come catturato dal time-lapse imaging (Supplemental Video 1). Gli isolotti rimanenti appaiono vuote al centro (dati non riportati) e presumibilmente non funzionale. Quindi, escludiamo isolotti con centro scuro durante il processo di raccolta manuale. Importante, abbiamo scoperto che una bassa temperatura di incubazione in seguito alla procedura di isolamento (Punto 4.2) può ridurre drasticamente il numero di isolotti che si svilupperà necrosi centrale nella cultura nel tempo. Nella procedura di trapianto di isole, a due passi sono fondamentali: induzione chimica di diabete e la consegna di isolotti nella zona dei reni sotto-capsula. Per l'induzione del diabete, l'obiettivo è quello di raggiungere iperglicemici in più del 90% dei STZ-iniettato nei topi. Questi topi sopravvivere senza trapianto per diverse settimane. La dose ottimale di STZ per raggiungere questo obiettivo varia a seconda ceppi di topi ed età, e dovrebbe essere determinato sperimentalmente. Abbiamo scoperto che una differenza piccola come 20mg/kg di peso corporeo può fare una grande differenza. Quindi, una titolazione con intervalli stretti deve essere eseguita. Per trapianto di isole, una considerazione chiave è il modello, che può avere quattro contesti immunologici: singenico, allogenico, autoimmuni singenici, e allogenico autoimmuni. Nel modello singenici, il ceppo donatore è lo stesso ceppo destinatario. Così, le isole non invocare il adattiva risposta immunitaria da parte dei beneficiari. Questo permette ai ricercatori di studiare le questioni che circondano "primarie non funzionare", un termine che si riferisce a isolotto disfunzione e la perdita a causa di motivi diversi da quelli specifici rigetto immunitario da parte dei beneficiari. Primarie non funzione è pensato per essere il motivo principale per il fallimento delle isole nella fase di trapianto precoce e per l'esigenza di un gran numero di isolotti (≥ 2 pancreas / paziente) per raggiungere euglicemia. Quindi, è un problema critico per il trapianto di isole. In questo modello, una massa isolotto marginale che non ripristinare completamente normoglicemia dovrebbero essere utilizzate e i topi devono essere esaminati per la glicemia nella fase iniziale dopo il trapianto, di solito tra il POD POD 1 a 7. Nella nostra esperienza, una massa marginale di isolotti è tipicamente tra 150 e 250 isolotti di media grandezza per 20 grammi destinatario utilizzando il C57BL / 6 ceppo di topi. Con il modello singenici, si può usare geneticamente o farmacologicamente isolotti modificato per verificare se una modulazione particolare colpisce l'efficacia terapeutica degli isolotti nella fase iniziale dopo il trapianto. Nei modelli allogeniche e autoimmuni, gli innesti isolotto sono esposti ad un attacco immunitaria specifica l'host-immunità adattativa, che coinvolge i linfociti T, linfociti B, e di altre cellule immunitarie. Adaptive-immunità è una risposta immunitaria ritardata, a test questa risposta, è necessario trapiantare un numero saturando di isolotti che ripristina in modo efficace normoglicemia nella fase iniziale dopo il trapianto per ridurre al minimo l'impatto delle primarie non funzione. Si può quindi monitorare l'intervallo di tempo prima che le isole vengono respinte, come indicato dalla perdita di normoglicemia per determinare gli effetti di qualsiasi modifica di isolotti sul rigetto del trapianto. Nella nostra esperienza, più di 300 isolette sono tenuti per 20 grammi del mouse e 15 a 21 giorni sono il tempo di rigetto di un trapianto allogenico con cellule Balb / c (H-2 d), i donatori e C57BL / 6 (H-2 b) destinatari. Figura 1. Individuazione l'apertura duodenale del dotto biliare comune. Endogena enzimi digestivi drenante del fegato, del pancreas e della cistifellea passare attraverso il dotto biliare comune prima di entrare nel tratto intestinale al duodeno. La direzione del flusso attraverso il condotto può essere invertito se la pressione è applicata al sistema con l'aggiunta di fluido esterno. Questo si tradurrà nel pancreas diventando pieno e disteso. Figura 2. Serraggio duodenale l'apertura del dotto biliare comune. Per riempire il pancreas con Liberase, è necessario bloccare l'apertura duodenale del dotto biliare comune. Se questo non avviene correttamente, Liberase riempirà l'intestino al posto del pancreas. Figura 3. Riposizionamento il fegato contro il diaframma consente la visualizzazione della regione prossimale del dotto biliare comune. Incannulazione del dotto biliare comune può essere raggiunto con maggior successo, se si cerca vicino alla sua estremità prossimale (a forma di V confluenza descritti in 2.3.1). Figura 4. Cannulating il dotto biliare comune con il 'liberomano 'metodo. Una confluenza del dotto biliare comune diventa visibile quando la hemostat che è bloccato il duodeno è tirato verso l'estremità posteriore del mouse. Incannulazione del dotto può essere ottenuto posizionando il 27 gauge in questa confluenza e la guida attraverso di essa. Figura 5. Cannulating il dotto biliare comune con la 'pinza assistere' metodo. Come accennato nel testo, a volte il tessuto fasciale che circonda il condotto rende difficile cannulate. (A) In questi casi, è utile per eliminare lo strato del viso con l'ago 27 gauge. (B) Il condotto può quindi essere visualizzati in modo chiaro e supportato da una coppia di pinze braccio piegato. (C) Con le pinze come un fermo, i 27 gauge possono essere inseriti nel condotto per la consegna di Liberase. Figura 6. Anche l'espansione del pancreas indica il posizionamento ottimale ago. Data la natura traslucida del condotto e tessuti circostanti fasciali, in alcuni casi può sembrare che il canale è stato cannulata quando in realtà non è così. Se ciò si verifica e l'ago penetra nella capsula pancreatica, la regione duodenale del pancreas inizierà ad espandersi al momento della consegna del Liberase. Tuttavia, l'intero pancreas non saranno perfusi e questo si tradurrà in rendimenti isolotto basso. Per evitare questo problema, guarda anche per l'espansione del pancreas da parte specificamente alla ricerca di segni di enzima entrare nella regione del pancreas fissata alla parte anteriore dello stomaco. Figura 7. Rimozione del pancreas perfuso. Per rimuovere il pancreas dal mouse, diversi punti di contatto con i visceri devono essere rotto. (AB) Separare il pancreas dagli intestini. (C) Separare il pancreas dallo stomaco. (D) Separare il pancreas dagli intestini. (EF) Tagliare le restanti contatti con la cavità peritoneale. Figura 8. Immagini rappresentative di isolotti. La purezza e la qualità relativa delle isole può essere stimata microscopicamente al completamento della procedura di isolamento. (A) Mentre l'obiettivo è quello di purificare isole dal pancreas, le cellule esocrine e detriti sono occasionalmente presenti. (B) Lo sforzo di isolamento delle isole possono indurre la morte delle cellule che si manifesta il più scuro regioni centrali degli isolotti e desquamazione delle cellule dalla periferia isolotto. (C) Quando la raccolta isolotti per un esperimento, evitare di raccogliere le cellule esocrine contaminanti. (D) isolotti cambiamento di aspetto con il tempo nella cultura. Come isolotti recuperare dall'isolamento, acquistano una superficie liscia periferica. Occasionalmente in grandi isolotti una regione scura centrale è visibile. Queste cellule macchia positivo per la morte delle cellule. Video 1 supplementare. Microscopia lasso di tempo post-isolamento isolotti. In questo video ore 16 lasso di tempo le isole si può vedere lo sviluppo di centri necrotici che sono in ultima analisi, espulso. Si prega di cliccare qui per il video .