Многоцветный Покадровый изображений трансгенных данио рерио: Визуализация сетчатки стволовых клеток, активированных нейронов Целевые абляция сотовый

1. Трансгенные и мутантных линий Создание / приобретение трансгенных линий данио, которые имеют типы клеток интерес дифференциально помечены флуоресцентным варианты репортер. Оптимально, возбуждение / излучение профиля выбранного репортеры должны иметь минимальное перекрытие (например, ECFP и EYFP), однако это не абсолютно необходимо. Для наших целей, использование мембран привязаны флуоресцентные журналистам значительно облегчает съемку штраф сотовой детали, такие как neuritic процессов, решить отдельные номера сотовых и / или морфологией в больших comingled групп и "выделить" регионы с высоким содержанием мембраны, такие как синаптических neuropils. Для визуализации в конце личиночной стадии, было бы полезно для получения / кросс трансгенных линий в мутанта фонов, которые уменьшают пигментацию [например, Рой Орбисон (Roy) и Рой Орбисон, альбинос (Рой, стихарь); 4]. По нашему опыту, снижение iridiphores (например, Рой) является наиболее важным вопросом, меланогенеза могут быть решены химически с использованием 1-фенил 2-тиомочевины (ПТУ) или "белых" мутантов у которых нет меланофоры. Заметим, однако, что Рен и соавт. 4, показали визуальные дефициты и скромные морфологические изменения в сетчатке рыб отсутствует melanaphores, и что интенсивный свет может вызвать фоторецепторов смерти в "белых" мутантов. Таким образом, эти вопросы должны быть приняты во внимание при разработке изображений экспериментов и / или интерпретации данных. Для этой демонстрации, трансгенных и мутантных рыб линий были использованы: Tg (NYX: Gal4-VP16) q16a / +; Tg (БАС: gap43-YFP) q16b / +; Tg (БАС-E1b: NfsB-mCherry) c264 / +; Tg (pax6-DF4: gap43-CFP) Q01 / +; Рой a9/a9 Примечание: В рыбы "1", субпопуляции Никс-промоутер определены биполярных клеток сетчатки выразить мембраны с метками YFP и / или NTR-mCherry слияние репортер (большинство выразить то и другое), и почти все клетки сетчатки выразить мембраны с метками CFP . Рыба "2", что и выше, кроме клетки глии Мюллера выразить цитозольного GFP и глобальных сетчатки выражение CFP была ликвидирована. Выражение NTR-mCherry слияние оказывает Никс определенные биполярные клетки восприимчивыми к пролекарство вызванных абляции 3,5. 2. Выбор и подготовка эмбрионов / личинки для живых изображений Мате трансгенных / мутантных линий интереса, собирать яйца и инкубировать / поддерживать на 28,5 ° С в растворе 0,3 x Danieau деньги (или эмбриона среды "по выбору). Если не в "белых" фон, ПТУ должны быть добавлены к ингибируют активность тирозиназы до каких-либо доказательств пигментации в ткани интерес (например, ~ 16 HPF для глаз, 200 мкМ финал). Обратите внимание, что лечение с ПТУ в концентрации более 75 мкМ может привести к токсичности и / или тератогенных эффектов. Однако, так как глаза очень пигментированы, лечения ниже 200 мкМ, не подходят для изображений с высоким разрешением конфокальной; в этих условиях важно, чтобы выбрать здоровый рыбы для работы с изображениями. Для визуализации других тканей, 75 мкМ ПТУ может быть предпочтительнее. Кроме того, как отмечалось выше, использование «белых» мутантных линий устраняет необходимость для лечения эмбрионов с ПТУ и является предпочтительной стратегией для работы с изображениями в конце личиночной стадии. После флуоресцентные журналистам очевидны, сортировать рыбу по экспрессии трансгена и общее состояние здоровья использованием флуоресцентного микроскопа зум стерео или аналогичный. До первого дня изображений, растворить низкой расплава агарозы (LMA) в зачаточном состоянии средней конечной концентрации 0,5%, тепла и смешать, чтобы получить в раствор, хранят при температуре 40 ° C. В первый день из изображений, подготовить решение для монтажа: Добавить tricaine (обезболивающий, 756 мкМ окончательный) и ПТУ (при необходимости) до 0,5% LMA в зачаточном состоянии среды, аккуратно перемешать и вернуть до 40 ° C. Обезболить рыбы путем передачи в эмбрион среде, содержащей ПТУ и / или tricaine, дать время для рыбы становятся не реагирует на касания (~ 3 мин). Передача отдельных рыб в монтажные решения, заботясь, чтобы не разбавлять агарозном так что он может быть использован повторно. Мы используем микропипетки с отделкой наконечник для передачи, что также помогает поддерживать контролируемый объем (~ 30 мкл). После приобретения, инвертировать пипетки и пусть рыба оседают на дно так, что прикосновение кончика к монтажной решение позволяет тяжести перевода без необходимости, чтобы развеять любые жидкости. После передачи, изгнать анестезии раствор из микропипетки и использовать его для перевода рыбы в ~ 30 мкл капли решение для монтажа в чашке Петри. Примечание: Этот способ монтажа имеет значение только для вертикальной микроскопии, где долгосрочные рабочее расстояние цели погружения в воду будет использоваться. Для меняthods отношение к инвертированных микроскопов, где покровные требуется, см. Андерсена и др., 2010;. О'Брайен и др., 2009;. Graeden и Sive 2009 года. Вернуться решение для монтажа до 40 ° C блок отопления. Использование кисти ресниц или аналогичных осторожно повернуть рыбу в желаемое положение и ориентацию области интереса в центре капли агарозы. Повторите шаги с 6 до 10 для установки желаемого количества эмбрионов за блюдо. Для серийного покадровой экспериментов (см. ниже) мы обычно горе шесть рыбы за один раз и пытаются ограничить изображений сессий до 1 часа на группу. При монтаже других рыб проверяйте, чтобы убедиться, предыдущие субъектов поддержания желаемой ориентации до агарозном затвердевает (~ 3 мин). После агарозном укрепил, транспортировки рыбы в конфокальной столик микроскопа и осторожно добавить эмбриона среде, содержащей ПТУ и / или tricaine к блюду, пока все рыбы они полностью погружены. 3. "Многоцветный" в естественных условиях конфокальной микроскопии Примечание: Мы постарались обобщить протокол ниже таких, которые он предоставляет соответствующую информацию для других конфигураций микроскоп. Конкретные ссылки на Олимп и приложений ImageJ программного обеспечения в кавычки. Наша система изображений Olympus FV1000 вертикально конфокальной микроскопии оснащена 405, 440, 488, 515, 559 и 635 нм лазеров, два переменной барьер фильтра каналов обнаружения (настраивая параметры, длина волны излучения в корректировке с шагом 1 нм), один стандартный барьер Фильтр канала (для красного и дальнего красного изображения), и один проходящем свете канала. Откройте для обработки изображений ("FV10-ASW") и использовать либо переданы или флуоресцентными источниками света, чтобы найти области интереса. Для оптимальной визуализации клеточных и / или молекулярных подробно использование долгосрочных рабочих целей расстояния с высокой числовой апертурой (например, 60X, 1.2NA). Если сбор проходящем свете изображения, фокус-полевой диафрагмой для освещения Колер. Выбирайте подходящий fluorphores от "Dye список" или загрузить приобретение параметры из ранее сохраненного файла изображения. Внесите изменения в выбросах диапазонах ("Спектральный Setting"), необходимые для четкого разделения репортер сигналов и / или максимального сигнала к шуму. Эти параметры должны быть определены эмпирически для каждого эксперимента, чтобы минимизировать перекрестные помехи, но максимально сигнала; параметры примеры, приведенные здесь, приведены ниже: Flourphores Лазеры (нм) Барьер Настройки / выбросов фильтр (нм) 1) ECFP, EYFP, mCherry * 440, 515, 559 * 460-500, 530-545, 575-675 2) EGFP **, EYFP **, mCherry 488, 515, 559 500-515, 530-545, 575-675 * Визуализация mCherry может быть улучшено с помощью выше длины волны лазера (например, 568 или 594 нм) ** Последовательном режиме визуализации позволяет дихроичных зеркал и барьерного фильтра изменений ("виртуальные каналы") необходим из-за выбросов / возбуждения перекрытия между GFP и YFP. GFP и mCherry могут быть отнесены к одному каналу, YFP на отдельный канал. Примечание: перекрестные помехи между GFP и YFP изображения будет видно до вычитания изображений (Часть 6). Убедитесь, что цель которого используется, выбирается в выпадающем меню, чтобы обеспечить любое программное обеспечение предустановок настроены должным образом. Для фокусировки лазера и уровни, установленные мощности, выберите посмотреть таблицу (LUT), которая показывает пиксель насыщения ("Привет-ло") для каждого канала. Установите чувствительность детектора ("ВН", PMT напряжения) до значения в соответствии с требуемого качества изображения (определяется эмпирически) и постепенно повышать лазера, пока интенсивность изображения приемлемо избежать пикселей насыщенности. Проверьте перекрестных помех между каналами; гарантировать, что каждый лазерной линии производит обнаруживаемый сигнал только в соответствующий канал вручную поворотом лазеров и выключается в то время как мониторинг всех каналов изображения. Для устранения перекрестных помех снижения мощности лазера. Если нет помех очевидно, все каналы могут быть получены одновременно обеспечивая значительную экономию времени. В случае неизбежны перекрестные помехи, используйте "Последовательный" режим съемки, который переключается между лазерами / каналов в отдельности. Крайних случаях (например, работы с изображениями и YFP GFP) требуют использования последовательного режима, которые также можно переключить дихроичных зеркал и / или барьер фильтры ("виртуальные каналы"). Примечание: эта опция вносит существенные временные задержки в процессе получения изображения и не может быть рpropriate для захвата высоко динамических процессов. «Масштаб» и «Вращение» функции могут быть использованы для дальнейшего кадров области интереса. Трансфокация также может быть использована для улучшения разрешения изображения, до пределов формате объективных и сканирования используется (например, 512 х 512, для информации об этих проблемах см., http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . PDF). Для изображения в естественных условиях в целом, и особенно важно для покадровой обработки изображений, методы, которые минимизируют фототоксичности вопросов (например, накопление свободных радикалов) должны быть подчеркнуты; высокая скорость сканирования (например, 2 мкс / пиксель) и низкое выходное лазерное уровня (например, 1%) следует использовать по возможности, а также низкий формат разрешения сканирования достаточно для захвата важную информацию. Для улучшения разрешения изображения, сканирование усреднения ("Кальмана") может быть использована во время приобретения. Более медленные скорости сканирования и повысить разрешение, но и активизируют лазерной время выдержки, которая обострит фототоксичности и отбеливания вопросов. Обратите внимание, что оба эти подхода не являются идеальными для покадровой из-за возможных за неспособность захватить быстрые изменения по Z-серии, феномен, который мы называем "время размытия". Обратите внимание, что усреднение по линии против за кадром может помочь устранить "время размытия" вопросы в рамках одной плоскости, но не через Z-глубины. Если сигнал интенсивности низких и максимальное разрешение изображения не требуется (например, простой подсчет числа клеток), повышение конфокальной диафрагмы (отверстие диаметром) может быть использована для повышения сигнала. Это служит держать лазерной интенсивности низких, сокращая фототоксичности и отбеливания, однако регулировка диафрагмы значение больше 1 воздушную единицу приводит к быстрой потери качества изображения. Определить Z-глубина измерениях, используя быстрый режим сканирования ("Фокус x4"). Поскольку интенсивность сигнала как правило, уменьшается с Z-глубины лучше всего начать Z-Stack приобретения по самой низкой глубины и заканчиваются в самый поверхностный, это позволяет более трудным сигналов, приобретенные до значительных отбеливания происходит. Проверьте наличие достаточного обнаружения сигнала по всей глубине изображения. При желании г-размерность коррекцию яркости функции ("Светлый Z") можно использовать для настройки параметров получения изображений при заданных глубин. Установить г-размерность шага по экспериментальным потребностей. Например, в нашем первом примере (рис. 1) мы были просто взять "клетка переписи в отдельных сетчатки более последовательных дней, таким образом, мы устанавливаем Z-глубину до 15 микрон и взял 6:55 изображений в сетчатке. Эта стратегия позволила нам образец сетчатки каждого без каких-либо сотовой перекрытия между изображениями. В нашем втором примере (рис. 2), мы провели быстрое 4D замедленной фильмы, в которых GFP и mCherry сигналы должны быть пространственно коррелированные, таким образом, мы устанавливаем размер шага в три раза теоретические латеральное разрешение компромисс, который позволил Z-Stack изображений которые должны быть приняты каждые 5-10 минут, но все еще служил для решения отдельных клеточных подробно. Получение изображений ("XYLZt") и сохранить. Переходите к следующему рыбы, если выполнять серийные покадровой экспериментом (см. # 4 ниже). Для быстрого покадровой визуализации см. # 5 ниже. 4. Последовательный "Поймать и отпустить" изображений: Метод слежения Сотовая Изменения в отдельных рыб За несколько дней подряд "Поймал-отпустил" протокол используется, чтобы минимизировать количество времени рыба иммобилизованных и увеличить количество рыбы отображаемого в эксперименте. Полезность этого метода ограничивается биологическими процессами, которые разворачиваются в течение нескольких дней (например, Mumm и соавт. 2006 г. 2). Одним из преимуществ такого подхода является то, что она позволяет любому наблюдаемые изменения быть внутренне контролируемых, т.е. сравнений между различными состояниями людей, а не среди населения. Например, отслеживание изменений в число меченых клеток в данной ткани могут быть выполнены точно, даже если количество клеток изначально помечены сильно варьируется между отдельными рыбы. Методы для использования этого протокола в контексте пролекарство вызванной ячейки абляции анализа 3,5 приведены здесь. Для визуализации абляции и регенерации целевых типов клеток в отдельных рыб в течение долгого времени, конфокальная изображений, приобретенных до пролекарство администрации (Предварительная обработка), сразу же после удаления пролекарство (после лечения) и в период выздоровления (восстановление изображений). Предварительная обработка изображений: Рыба установлены и отображаемого как указано выше. Как только рыба была отображаемого они попадают эмбриона среды (+ пролекарством) и инкубировали при 28,5 ° С до пост-обработка изображений сессии. Работа в группах по два, один монтаж и выпуск рыбы, других изображений является хорошим способом увеличить количество рыб, которые могут быть отображены в день. После визуализации всех рыб в одном блюде заменить эмбриона среде, содержащей tricaine с эмбрионом среду один (+ / – ПТУ). Для освобождения рыбы, использования ювелирами щипцы, чтобы прорваться через агарозном по обе стороны личинки, а затем аккуратно дразнить агарозном подальше, пока рыба плавает свободно в зародыше среды. Пролекарство вызванных абляции: Трансфер личинок в отдельных скважин пластины многоямного содержащие эмбриона среды (+ / – ПТУ) + пролекарство (например, 10 мМ метронидазол, МТЗ). Для обеспечения точности конечной концентрации пролекарство мы обычно аликвоту определенного объема эмбриона среды (+ / – ПТУ), содержащий 2X концентрации предшественника (например, 20 ммоль) в каждую лунку. Рыбы затем добавил к скважинам в равном объеме эмбриона среды (+ / – ПТУ), чтобы конечная концентрация пролекарство к 1X. Инкубируйте при 28,5 ° С до целевой ячейки абляции может быть проверено. Примечание: пролекарство схемы лечения, необходимых для достижения успешной абляции варьироваться в зависимости от типа клеток целевые; пролекарство концентрацию и продолжительность лечения должны определяться эмпирически, имейте в виду, что высокие концентрации вызывают общей токсичности, например,> 10 ммоль МТЗ. Кроме того, perdurance фрагментированных сигналы репортер может осложнить оценку абляции успех, в некоторых случаях конфокальной микроскопии необходимо адекватно визуализировать потерю клеток. Последующая обработка изображения: Рыба смонтированы так, что же ткани оптимально ориентированных и отображаемого как указано выше. После того как все рыбы на данной пластине были отображаемого они попадают эмбриона среды (+ / – ПТУ) в отдельных скважинах (см. выше) и инкубировали при 28,5 ° C, чтобы восстановление удаленной типа клеток. В зависимости от возраста рыбы и время, необходимое для восстановления может быть необходимо кормить рыб во время этой стадии анализа. Мы используем живого корма, такие как парамеции или коловраток для обеспечения оптимального выживания. Кроме того, целесообразно предоставить свежие средства массовой информации ежедневно, особенно если рыба ведутся в небольших объемах (например, 96-луночных). Восстановление изображения: Чтобы документ кинетики клеточных замены, рыба может быть отображены на ежедневной основе в течение периода восстановления. После кинетики были созданы анализа может быть упрощена за счет приобретения восстановления изображения только на время точек интереса (например, полное восстановление). На рисунке 1 представлен пример такого подхода от наших исследований регенерации сетчатки клетки. По завершении эксперимента рыба должна быть умерщвлены путем погружения в 20х tricaine (15,3 ммоль) раствора на льду. 5. Быстрое Покадровый Imaging. Для быстрого покадровой съемки (то есть, "Фильмы") нескольких fluorphores, методы, которые минимизируют фототоксичности вопросы имеют решающее значение (см. выше). Как уже говорилось выше, этот метод лучше всего подходит для fluorphores позволяя одновременно, а не последовательными, работы с изображениями Поддерживать рыбы в 28,5 ° С, используя нагревательный столик, ITO стекла нагревательный элемент, или аналогичный. Использование методов, которые уменьшают испарение, чтобы помочь стабилизировать температуру и осмолярность (например, уплотнительное кольцо запечатанном покровные для инвертированных микроскопов). При использовании автоматизированных приобретение в течение длительного времени быть обязательно задайте размер стека для обеспечения роста и / или дрейф в г-размерность. Установите временные интервалы и количество сканирования ("TimeScan" или "TimeController"). Приобретение ставки должны устанавливаться эмпирически в соответствии с динамикой биологический процесс, отображаемого и / или корректировать в соответствии фототоксических свойства чувствительности клеточных популяций, представляющих интерес. Получение изображений ("XYLZt") и сохранить. Для построения "Фильмы", областей, представляющих интерес должны быть определены и согласованы в х, у и z. размеров. Полный процесс выходит за рамки данного обзора протокола, но несколько компьютерных программ доступны, которые также облегчают масштабирование, вращение, панорамирование и функций во время 4D образ сборки (Volocity, Амира и т.д.). 6. Спектральная обработка изображений Разделение использованием ImageJ Freeware Оптимально, при выполнении нескольких репортер изображений эксперимента лучше всего использовать fluorphores, которые хорошо отделены спектрально. Однако, это не всегда практично и / или возможные. Здесь мы предлагаем упрощенный метод разделения fluorphores, которые имеют перекрытие возбуждения и эмиссии профилей, в этом случае GFP и YFP. В примере, при условии, мы использовали покадровой методы визуализации, описанные выше для отслеживания поведения GFP-меченых сетчатки »стволовых клеток, глия Мюллера, в ходе адресных абляции и регенерации клеток сетчатки биполярного помечены YFP и NTR-mCherry (рис. 2). Сбор фотографий с помощью последовательных режимах съемки и набор фильтров, которые позволяют барьер перекрытия флуорофоров приобретаемых самостоятельно, так и частично разделены, соответственно (см. выше GFP / YFP пример настройки). Для удаления помех мы используем простой вычитания изображений стратегии, которая удаляет один каналам сигнал от другого. Изображение Вычитание процесс: Instalл последнюю версию ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), Loci Био-форматы инструмент (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) и выравнивать стеки плагин (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html). Используйте Loci Био-форматы импорта плагин для открытия файлов изображений, просто перетащив файл интерес на окна ImageJ начнет импортировать инструмент. Разделение каналов на отдельные стеки использованием "Сплит Каналы" флажок в окне импорта или "Сплит Каналы" на вкладке "Инструменты канал" (Shift + Ctrl + Z) после загрузки. Начало Совместите 3 TP плагин (плагины> Align стеки> Align 3 ТП). Стеки необходимо привести в соответствие для обеспечения надлежащего вычитания. Выберите ссылку стека в первом выпадающем списке и неправильное выравнивание стека в секунду. Проверьте "ху использовать относительные происхождения" и "использование Z относительной происхождения" флажки и нажмите "OK". Чтобы запустить процесс выравнивания, нажмите кнопку «Volume Регистрация". Появится новое окно, содержащее параметры выравнивания. Этот раздел был оптимизирован дистрибьютором плагин, никаких изменений необходимы, просто нажмите кнопку "OK". Когда закончите, "неприсоединения Стеки" окно. Выберите "Выход" из Выровняйте окна и окно Вывод должен появиться. В этом окне также оптимизирована и не нуждается в модификации. Нажмите "OK". Новый стек должен появиться в рабочее пространство с "неприсоединения" добавляется в конец файла, название. Перекрестные помехи будут удалены с помощью "Image Calculator" (Process> Image Calculator). Выберите стека вычету при Image1 выпадающего списка и стек используется в вычитание в image2 выпадающего списка. Выберите "вычитание" в операции выпадающего списка и нажмите кнопку "OK". ImageJ попросит процесс стека, выберите "Да". Новый стек должен появиться который снял перекрестных помех между перекрытием каналов. Чтобы воссоздать ту же структуру изображения перед выравнивание и вычитание Стеки должны быть объединены. Выберите "Объединить каналы" в окне канала Tools. Инструмент позволит вам объединять до четырех стеков в HyperStack. Примечание: Чтобы объединить более 4 стеки, объединения стеков в нужном порядке с помощью объединения инструмент (изображения> стеки> инструменты> объединения). Преобразование объединенное стека HyperStack (изображения> HyperStack> стека HyperStack). Конкатенация стеки изменения глубины, время, канал (zct) порядке, это должно быть сброшено в выпадающем окне, которое появляется, установить «порядок» xyztc, установите "каналы", "ломтики" и "кадры" в соответствии с Число стеков, глубина стека, а число временных точек, соответственно .. Наконец, все каналы должны быть раскрашенное, с поправкой на яркость и контрастность, а также сохранены в виде файлов TIFF. Отсюда, преобразование в RGB, монтаж, г-проекции, или временных рядов и тот же процесс, как и для исходных файлов. 7. Представитель Результаты Рисунок 1. Покадровой серии конфокальных изображений демонстрации целевых потери и регенерации NTR-mCherry выражения биполярных клеток сетчатки (эритроцитов). & ') До начала лечения есть мозаику экспрессии мембранных с метками YFP репортером в "контроле" биполярные клетки, как показано на желтый, а nitroreductase-Черри слитого белка в "целевых" bipolars показаны красным цветом. ) B & B "После лечения метронидазолом, красный nitroreductase экспрессирующих биполярные клетки, теряются, а желтый" контроль "биполярные клетки, были избавлены. Это свидетельствует о весьма специфический характер этой абляции методологии. ) C & C "Когда метронидазол удаляется, NTR-выражения (красный) клеток взамен. Рисунок 2. Представляет собой пример процесса вычитания изображений, что позволяет GFP и YFP быть чисто разделенных после приобретения. & ') До вычитание, GFP (зеленый) и YFP (pseudocolored фиолетовый) изображения выравниваются. B & B ') процесс вычитания позволяет YFP меченных биполярные клетки должны быть удалены из GFP изображения, позволяя GFP-меченых Мюллер глии, более легко обнаружить. C & C ') совместное выражение GFP (зеленый) и mCherry (красный) очевидна в клетке, указанном стрелкой. Потому что сотрудничество выражение клетка глии Мюллера маркер и биполярные ячейки маркер показывает, что абляция биполярного клетка запускает Мюллер глии для замены потерянных клеток. Такое толкование в соответствии с недавних исследований регенерации сетчатки которых вовлечь Мюллер глии, как «стволовые клетки» травм вызванных в обоих млекопитающих и рыб.