Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

1. Linhas de transgênicos e Mutant Estabelecer / adquirir linhas zebrafish transgênicos que têm tipos de células de interesse diferencialmente marcada com variantes repórter fluorescente. Idealmente, o perfil de excitação / emissão dos repórteres selecionados devem ter um mínimo de sobreposição (por exemplo, ECFP e EYFP), porém este não é absolutamente necessário. Para os nossos propósitos, o uso de membrana amarrados repórteres fluorescentes facilita enormemente imagens de multa detalhes celular, tais como processos neuríticas, para resolver os números de células individuais e / ou morfologia em grandes grupos comingled e 'destaque' regiões de conteúdo da membrana de alta, como neuropils sináptica. Para geração de imagens no final fases de larva, é útil para derivar / cross linhagens transgênicas em fundos mutante que reduz a pigmentação [por exemplo, Roy Orbison (roy) ou Roy Orbison; albino (roy; alb); 4]. Em nossa experiência, a redução do iridiphores (por exemplo, roy) é a questão mais crítica, melanogênese pode ser tratado quimicamente com 1-2-fenil tiouréia (PTU) ou com o "albino" mutantes que falta melanóforos. Note no entanto que Ren et al. 4, demonstraram déficits visuais e modestas alterações morfológicas na retina de peixes sem melanaphores, e que a luz intensa pode induzir a morte de fotorreceptores em "albino" mutantes. Assim, essas questões precisam ser levadas em consideração ao projetar experimentos com imagens e / ou dados de interpretação. Para esta demonstração, as linhas de peixes transgénicos e mutante utilizados foram: Tg (nyx: Gal4-VP16) q16a / +; Tg (UAS: gap43-YFP) q16b / +; Tg (UAS-E1b: NFSB-mCherry) C264 / +; Tg (PAX6-DF4: gap43-PCP) Q01 / +; roy a9/a9 Nota: Nos peixes "1", uma subpopulação de nyx promotor definidas as células da retina bipolar expressar uma membrana tag YFP e / ou um NTR-mCherry repórter de fusão (a maioria expressar tanto), e quase todas as células da retina expressar uma PCP membrana tag . Fish "2" são como acima, exceto as células glia Müller expressar GFP citosólica e expressão PCP globais da retina foi eliminada. Expressão da fusão NTR-mCherry torna células nyx definidos bipolar suscetíveis a pró-droga-induzida ablação 3,5. 2. Seleção e Preparação de Embriões / larvas de imagens ao vivo Companheiro de transgênicos / linhagens mutantes de interesse, recolher os ovos e incubar / manter a 28,5 ° C em solução 0.3X Danieau (ou 'medium embrião "de escolha). Se não for em um fundo "albino", PTU deve ser adicionado para inibir a atividade da tirosinase, antes de qualquer evidência de pigmentação no tecido de interesse (por exemplo, ~ hpf 16 para o olho, a 200 M final). Note-se que o tratamento com PTU em concentrações superiores a 75 mM pode causar toxicidade e / ou efeitos teratogênicos. No entanto, porque o olho é altamente pigmentada, tratamentos abaixo de 200 mM não são adequados para alta resolução de imagem confocal; sob essas condições é importante para selecionar os peixes com aspecto saudável para a imagem latente. Para os tecidos outras imagens, 75 mM PTU pode ser preferível. Além disso, como mencionado acima, o uso de "albino" linhagens mutantes elimina a necessidade de tratar os embriões com PTU e é uma estratégia preferida para a imagem latente no final de fases larvares. Uma vez que os repórteres são peixes fluorescentes tipo evidente, segundo a expressão do transgene e saúde em geral utilizando um microscópio de fluorescência de zoom estéreo ou similar. Antes do primeiro dia de imagem, dissolver baixo derreta agarose (LMA) em meio embrião para uma concentração final de 0,5%, calor e mix de entrar em loja de solução, a 40 ° C. No primeiro dia de imagem, prepare solução de montagem: Adicionar tricaina (um anestésico, 756 mM final) e PTU (se necessário) para LMA 0,5% em média do embrião, misture delicadamente, e voltar para 40 ° C. Anestesiar peixes através da transferência de embrião em meio contendo PTU e / ou tricaina, dar tempo para que os peixes se tornam não-sensível ao toque (~ 3 min). Transferência de peixes individuais em solução de montagem, tomando cuidado para não diluir a agarose para que ele possa ser reutilizado. Usamos uma micropipeta com ponta cortada para a transferência, o que também ajuda a manter um volume controlado (~ mL 30). Após a aquisição, inverter pipeta e deixar os peixes para liquidar o fundo, para que tocar a ponta para a solução de montagem permite a transferência de gravidade sem necessidade de dissipar qualquer líquido. Após a transferência, expulsar solução anestésica de micropipeta e usá-lo para transferir os peixes em uma gota ~ 30 mL de solução de montagem de uma placa de Petri. Nota: Este método de montagem só é relevante para microscopia em posição vertical, onde longa distância de trabalho objetivos imersão em água será usada. Para mimthods relevantes para microscópios invertidos, onde as lamínulas são necessários, ver Andersen et al, 2010;. O'Brien et al, 2009;. Graeden e Sive, 2009. Retorno solução de montagem a 40 ° C bloco de aquecimento. Usando uma escova dos cílios ou similar gire gentilmente peixe na orientação desejada e posição da região de interesse no centro da gota de agarose. Repita os passos 6-10 para montar o número desejado de embriões por prato. Para serial lapso de tempo experimentos (veja abaixo) que normalmente montar seis peixes de cada vez e tentar limitar sessões de imagem a 1 hora por grupo. Durante a montagem de outros peixes, volte para se certificar de assuntos anteriores manter a orientação desejada até agarose solidifica (~ 3 min). Depois de agarose solidificou, o transporte de peixe para estágio do microscópio confocal e delicadamente adicione médio embrião contendo PTU e / ou tricaina ao prato até que todos os peixes são completamente submerso. 3. "Multicolor" in vivo confocal Imagem Nota: Nós tentamos generalizar o protocolo abaixo de tal forma que ela fornece informações relevantes para configurações microscópio outros. Referências específicas a Olympus e aplicações de software ImageJ estão entre aspas. Nosso sistema de imagens é uma Olympus FV1000 microscópio confocal vertical equipado com 405, 440, 488, 515, 559 e 635 nm lasers, duas variáveis ​​barreira canais de detecção de filtro (permitindo configurações de comprimento de onda de emissão de ser ajustado em incrementos de 1 nm), uma barreira padrão filtro de canal (para o vermelho e imagem muito vermelha) e um canal de transmissão de luz. Abra o software de imagem ("FV10-ASW") e usar fontes de luz seja transmitida ou fluorescentes para localizar a região de interesse. Para otimizar a imagem do celular e / ou molecular uso pormenor os objectivos de longo trabalho à distância com alta NA (por exemplo, 60X, 1.2NA). Se tiver de pegar transmitido imagens de luz, o foco do diafragma de campo para iluminação Kohler. Escolha fluorphores apropriado da "Lista Dye" ou carregar parâmetros de aquisição a partir de um arquivo de imagem salvo anteriormente. Fazer ajustes às faixas de emissão ("Setting espectral") necessário para a separação limpa de sinais de repórter e / ou sinal de máxima às relações de ruído. Essas configurações precisam ser empiricamente definido para cada experimento para minimizar crosstalk, mas maximizar sinal; configurações para os exemplos fornecidos aqui são mostradas abaixo: Flourphores Lasers (nm) Configurações barreira / Emissão Filter (nm) 1) ECFP, EYFP, mCherry * 440, 515, 559 * 460-500, 530-545, 575-675 2) EGFP **, EYFP **, mCherry 488, 515, 559 500-515, 530-545, 575-675 * Imagem de mCherry poderia ser melhorado usando um laser de comprimento de onda maior (por exemplo, 568 ou 594 nm) ** Um modo de imagem sequencial permitindo mudanças dichroic espelho e barreira de filtro ("canais virtuais") é necessária devido à emissão / excitação sobreposição entre GFP e YFP. GFP e mCherry pode ser atribuído a um canal, YFP para um canal separado. Nota: crosstalk entre GFP e imagens YFP será evidente antes da subtração de imagem (parte 6). Certifique-se que o objetivo a ser utilizado é selecionado no menu suspenso para garantir que qualquer software presets definidos são ajustadas corretamente. A concentrar-se lasers e os níveis de poder definir, selecione um olhar para cima da tabela (LUT), que revela a saturação pixel ("Hi-lo") para cada canal. Sensibilidade do detector Set ("HV", a tensão PMT) para um valor consistente com qualidade de imagem desejada (definido empiricamente) e aumentar gradualmente até saída do laser intensidade da imagem é aceitável evitar a saturação pixel. Verifique se há interferência entre canais; garantir que cada linha de laser produz sinal detectável apenas no canal apropriado virando manualmente lasers e fora enquanto todos os canais de monitoramento de imagem. Para eliminar crosstalk reduzir o poder do laser. Se não crosstalk é evidente, todos os canais podem ser adquiridos em simultâneo proporcionando economia de tempo significativa. Em caso de crosstalk inevitável, use um modo de imagem "Sequential" que alterna entre lasers / canais individualmente. Casos extremos (por exemplo, imagens GFP e YFP) requerem o uso de modos sequenciais que também mudar espelhos dicróicos e / ou filtros de barreira ("canais virtuais"). Nota: Esta opção introduz significativas atrasos temporais no processo de aquisição de imagem e não podem ser appriados para a captura de processos altamente dinâmico. "Zoom" e "Rotation" funções podem ser usadas para enquadrar a área de interesse. Zoom também pode ser usado para melhorar a resolução de imagem, até os limites do formato objetivo e digitalização utilizado (por exemplo, 512 x 512; para obter informações sobre essas questões ver, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . pdf). Para in vivo de imagens em geral, e de particular importância para lapso de tempo de imagem, técnicas que minimizam problemas de fototoxicidade (ou seja, o acúmulo de radicais livres) precisam ser enfatizadas; velocidades de digitalização rápida (por exemplo, 2 mS / pixel) e saída laser de baixa níveis (por exemplo, 1%) deve ser usado sempre que possível, bem como o formato de menor resolução de digitalização adequado para capturar informações importantes. Para melhorar a resolução de imagem, digitalização média ("Kalman") pode ser usado durante a aquisição. Velocidades mais lentas também melhorar a resolução de digitalização a laser, mas aumento de tempo de permanência, o que irá agravar a fototoxicidade e questões de branqueamento. Note-se que ambas as abordagens não são ideais para lapso de tempo devido ao potencial para a incapacidade de captar mudanças rápidas em um z-series, um fenômeno que chamamos de "blur tempo". Note que a linha média em relação a quadro pode ajudar a eliminar o "tempo blur" questões dentro de um único plano, mas não através z-profundidade. Se intensidades de sinal são baixos e resolução máxima de imagem não é necessário (por exemplo, simplesmente contando o número de células), aumentando a abertura confocal (diâmetro pinhole) pode ser usado para aumentar sinal. Isso serve para manter a laser de baixa intensidade, reduzindo fototoxicidade e branqueamento, porém ajustando a abertura para um valor maior do que 1 unidade arejado rápida leva a perdas na qualidade da imagem. Definir z-depth dimensões usando um modo de varredura rápida ("Focus x4"). Porque a intensidade de sinal geralmente diminui com z-depth, é melhor começar a z-stack aquisições com o menor profundidade e termina na mais superficial, isto permite que os sinais mais difíceis de serem adquiridos antes significativos de branqueamento ocorre. Verificação para detecção de sinal é adequada ao longo da profundidade da imagem. Se desejar, uma dimensão z função de correção de brilho ("Z Brilhante") pode ser usado para ajustar os parâmetros de aquisição de imagens em profundidades especificadas. Definir o tamanho do passo-z dimensão acordo com as necessidades experimental. Por exemplo, no nosso primeiro exemplo (Figura 1) que foram simplesmente tomar um 'censo célula em retinas indivíduo ao longo do dia sucessivo, portanto, vamos definir o z-profundidade a 15 microns e levou 5-7 imagens por retina. Essa estratégia permitiu-nos a amostra de cada retina sem sobreposição entre as imagens de celular. Em nosso segundo exemplo (Figura 2), foi realizada uma rápida 4D com lapso de tempo em que filmes de GFP e mCherry sinais precisava ser espacialmente correlacionados, portanto, vamos definir o tamanho do passo a três vezes a resolução teórica laterais um compromisso que permitiu z-stack imagens a serem tomadas a cada 5-10 minutos, mas ainda serviu para resolver detalhes celular individual. Aquisição de imagens ("XYLZt") e salvar. Passar para o peixe que vem se realizando um experimento de lapso de tempo de série (ver item 4 abaixo). Para o rápido time-lapse imagem veja # 5 abaixo. 4. "Catch and Release" Serial Imaging: um método para controlar alterações de celular em peixes individuais ao longo de dias sucessivos A 'pesque e solte' protocolo é usado para minimizar a quantidade de peixes de tempo são imobilizados e aumentar o número de peixes fotografada por experimento. A utilidade desta técnica está limitada a processos biológicos que se desenrolam ao longo de dias (por exemplo, Mumm et al. 2006 2). Uma vantagem dessa abordagem é que permite que todas as mudanças observadas a ser controlada internamente, ou seja, as comparações entre diferentes estados de indivíduos e não nas populações. Por exemplo, o rastreamento de alterações no número de células marcadas presentes em um dado tecido pode ser realizada com precisão, mesmo que o número de células inicialmente rotulada varia muito entre os peixes individual. Métodos para usar este protocolo dentro do contexto de um ensaio de ablação pró-fármaco-induzida de célula de 3,5 são fornecidas aqui. Para visualizar a ablação e regeneração de tipos de células-alvo em cada peixe ao longo do tempo, imagens confocal são adquiridos antes da administração pró-fármaco (pré-tratamento), imediatamente após a retirada pró-fármaco (Pós-tratamento) e durante o período de recuperação (Recovery imagens). Pré-tratamento de imagem: Peixes são montados e representado como acima. Uma vez que os peixes têm sido fotografados eles são liberados no meio de embriões (pró-fármaco +) e incubadas a 28,5 ° C até que a sessão de imagens pós-tratamento. Trabalhando em equipes de dois, um de montagem e liberação de peixes, a imagem outra é uma boa maneira de maximizar o número de peixes que podem ser visualizados por dia. Depois de imagem todos os peixes em um prato único meio de substituir o embrião contendo tricaina com embrião meio sozinho (+ / – PTU). Para soltar os peixes, utilize uma pinça joalheiros para cortar agarose em ambos os lados das larvas e, em seguida, delicadamente provocar agarose afastado até que o peixe flutua livremente em meio embrião. Pró-fármaco induzida por ablação: Transferência de larvas em um indivíduo poço de uma placa com vários poços contendo meio de embrião (+ / – PTU) + pró-fármaco (por exemplo, 10mM metronidazol, MTZ). Para garantir precisão concentrações pró-fármaco final que normalmente alíquota um volume definido de meio de embrião (+ / – PTU) contendo uma concentração 2X de pró-fármaco (por exemplo, 20 mM) em cada poço. Os peixes são então adicionados aos poços em um volume igual de meio de embrião (+ / – PTU) para reduzir a concentração pró-fármaco final para 1X. Incubar a 28.5 ° C até que a ablação de células-alvo pode ser verificada. Nota: os regimes pró-droga que requer tratamento para conseguir a ablação bem sucedida variam de acordo com o tipo de célula-alvo; concentração de pró-droga ea duração do tratamento terá de ser determinada empiricamente, estar ciente de que altas concentrações causam toxicidade geral, por exemplo,> 10 mM MTZ. Além disso, perdurance de sinais repórter fragmentada pode complicar as avaliações de sucesso da ablação, em alguns casos, microscopia confocal é necessário para visualizar adequadamente a perda de células. Pós-tratamento de imagem: Peixes são montados de tal forma que o mesmo tecido é ideal orientada e trabalhada como acima. Uma vez que todos os peixes em uma dada placa ter sido fotografada eles são liberados no meio de embrião (+ / – PTU) em poços individuais (como acima) e incubadas a 28,5 ° C para permitir a regeneração do tipo de célula ablated. Dependendo da idade do peixe e do tempo necessário para a recuperação pode ser necessário para alimentar os peixes durante esta fase do ensaio. Usamos alimento vivo, como paramécios ou rotíferos para garantir a sobrevivência ideal. Também é aconselhável fornecer meios frescos diariamente, principalmente se os peixes são mantidos em baixos volumes (por exemplo, 96 placas bem). Recuperação de imagem: Para documentar a cinética de substituição de células, os peixes podem ser visualizados em uma base diária durante o período de recuperação. Uma vez que a cinética de ter sido estabelecido o ensaio pode ser simplificada através da aquisição de imagens de recuperação apenas em momentos de interesse (de recuperação, por exemplo, completa). A Figura 1 apresenta um exemplo desta abordagem de nossos estudos de regeneração de células da retina. Na conclusão do experimento os peixes devem ser sacrificados por imersão em solução tricaina 20X (15,3 mM) sobre o gelo. 5. Imagem lapso de tempo rápido. Para o rápido tempo-lapso de imagem (ie, 'movies') de fluorphores múltiplos, técnicas que minimizam problemas de fototoxicidade são críticos (veja acima). Como dito acima, esta técnica é mais adequada para fluorphores permitindo simultânea, ao invés de seqüencial, imagem Manter peixes em 28,5 ° C usando um estágio aquecida, ITO elemento de aquecimento de vidro ou similar. Utilizar métodos que reduzem a evaporação para ajudar a estabilizar a temperatura e osmolaridade (por exemplo, o-ring lamínulas selado para microscópios invertidos). Se estiver usando mais de aquisição automatizada vezes estendida certifique-se de definir o tamanho da pilha para permitir o crescimento e / ou deriva no z dimensão. Definir intervalos de tempo e número de exames ("TimeScan" ou "TimeController"). Taxas de aquisição terá de ser estabelecida empiricamente de acordo com a dinâmica do processo biológico com imagens e / ou ajustado de acordo com as propriedades fototóxicas sensibilidade da população celular de interesse. Aquisição de imagens ("XYLZt" botão) e salve. Para a construção de 'filmes', áreas de interesse deverão ser definidos e alinhados no x, y, z e dimensões. Todo o processo está além do escopo desta revisão protocolo, mas vários programas de software estão disponíveis, que também facilitam a rotação, zoom, panning e funções durante a 4D imagem de montagem (Volocity, Amira, etc.) 6. Processamento de Imagem espectral Separation usando ImageJ freeware Da melhor maneira, ao realizar uma experiência multi-repórter de imagem é melhor usar fluorphores que são bem separados espectralmente. No entanto, isso nem sempre é prático e / ou possível. Aqui nós fornecemos um método simplificado para separar fluorphores que têm sobreposição de perfis de excitação e emissão, neste caso e GFP YFP. No exemplo fornecido, temos utilizado as técnicas de lapso de tempo de imagem descrito acima, para controlar o comportamento de GFP-rotulados retina "células-tronco ', glia Müller, durante a ablação orientada e regeneração das células da retina bipolar rotulados com YFP e NTR-mCherry (Figura 2). Coletar imagens usando os modos de imagem sequencial e filtros barreira variável que permitem fluoróforos sobrepostas a ser adquirido de forma independente e parcialmente separados, respectivamente (veja acima GFP / YFP exemplo configurações). Para remover crosstalk usamos uma simples estratégia de subtração de imagem que remove um sinal de canais de outro. Processo de subtração de imagem: Install da versão mais recente do ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), ferramenta Loci Bio-Formatos (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) e alinhar pilhas plug-in (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html). Use o Loci Bio-Formatos de Importação plug-in para abrir arquivos de imagem, basta arrastar o arquivo de interesse para a janela ImageJ vai iniciar a ferramenta de importação. Dividir os canais em pilhas individuais usando o "Canais de Split" caixa de seleção na janela de importação ou a "Canais Split" guia em "Ferramentas Channel" (shift + ctrl + z) após o carregamento. Iniciar o Align 3 TP plugin (plugins> Alinhar stacks> Alinhar 3 TP). As pilhas precisam ser alinhadas para garantir a subtração correta. Selecione a pilha de referência na primeira caixa dropdown ea pilha de mis-alinhados no segundo. Marque a opção "use origem xy relativa" e "use z relativa origem" caixas e clique em "OK". Para iniciar o processo de alinhamento, clique no "Volume de registro" botão. Uma nova janela aparecerá que contém os parâmetros de alinhamento. Esta seção foi otimizado pelo distribuidor do plugin, sem modificações são necessárias, basta clicar em "OK". Quando terminar, um "Alinhados Stacks" janela aparecerá. Selecione "Output" a partir da janela Align ea janela de saída deve aparecer. Esta janela também é otimizado e não precisa de modificação. Clique em "OK". Uma pilha nova deve aparecer no espaço de trabalho com "Alinhados" anexado ao final do título do arquivo. Crosstalk será removido usando a "Calculadora Image" (Processo Calculadora imagem>). Selecione a pilha para ser subtraída na caixa dropdown Image1 ea pilha usada na subtração na caixa Image2 suspensa. Selecione "Subtrair" na caixa de Operação suspenso e clique em "OK". ImageJ irá pedir para processar a pilha, selecione "Yes". Uma pilha nova deve aparecer que removeu o crosstalk entre os canais que se sobrepõem. Para recriar a estrutura mesma imagem antes Stacks alinhamento e subtração precisam ser mescladas. Selecionar "Canais Merge" na janela de Ferramentas Channel. A ferramenta permitirá que você mesclar até quatro pilhas em um hyperstack. Nota: Para mesclar mais de 4 pilhas, pilhas concatenar na ordem desejada utilizando a ferramenta de concatenar (imagens> stacks>> Ferramentas de concatenar). Converter a pilha concatenado a um hyperstack (imagens> hyperstack pilha> para hyperstack). Concatenação das pilhas muda a profundidade, tempo, canal de ordem (ZCT), isso precisa ser reposto dentro da caixa dropdown que aparece, definir a "ordem" para xyztc, set "canais", "fatias" e "frames" de acordo com a número de pilhas, a profundidade da pilha, e número de pontos no tempo, respectivamente .. Finalmente, todos os canais precisam ser colorida, ajustada para o brilho e contraste, e salvo como arquivos TIFF. A partir daqui, a conversão para RGB, montagem, z-projeção, ou de séries temporais é o mesmo processo utilizado para os arquivos originais. 7. Resultados representante Figura 1. Uma série de lapso de tempo de imagens confocal demonstrando perda orientada e regeneração de NTR-mCherry expressando as células da retina bipolar (glóbulos vermelhos). A & A ') Antes do tratamento há expressão mosaico de repórter membrana tag YFP no "controle" células bipolares, mostrada em amarelo, e nitroreductase-Cherry proteína de fusão em "alvo" bipolares mostradas em vermelho. Tratamento B & B ') Na sequência com metronidazol, o vermelho nitroreductase células que expressam bipolar, são perdidos, enquanto o amarelo "controle" células bipolares, são poupados. Isto demonstra a natureza altamente específica desta metodologia de ablação. ) C & C "Quando metronidazol é removido, expressando-NTR (vermelho) return células. Figura 2. Fornece um exemplo do processo de subtração de imagem que permite GFP e YFP ser claramente separadas após a aquisição. A & A ') Antes de subtração, a GFP (verde) e YFP (pseudocolored roxo) as imagens são alinhadas. B & B ') O processo de subtração permite que as células-YFP rotulados bipolar para ser removido da imagem GFP, permitindo GFP-rotulados glia Müller para ser mais facilmente detectada. C & C ') Co-expressão de GFP (verde) e mCherry (vermelho) é evidente na célula indicada pela seta. Porque Co-expressão do marcador de células glia de Müller e marcador de células bipolares sugere que a ablação de células glia bipolar triggers Müller para substituir as células perdidas. Esta interpretação está de acordo com estudos recentes de regeneração da retina, que implicam glia Müller como "células-tronco 'induzidas por lesão em ambos os mamíferos e peixes.