متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

1. خطوط المعدلة وراثيا والمسخ إنشاء / الحصول على خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي لديها أنواع الخلايا ذات الاهتمام المسمى تفاضلي مع المتغيرات مراسل الفلورسنت. على النحو الأمثل ، والوضع الإثارة / انبعاث للصحفيين المختارة ينبغي أن يكون الحد الأدنى من التداخل (على سبيل المثال ، وECFP EYFP) ، ولكن ليس هذا المطلوب تماما. لأغراضنا ، المربوطة استخدام غشاء صحفيين الفلورسنت يسهل كثيرا من التفاصيل التصوير الخلوية الجميلة ، مثل العمليات لالتهاب الأعصاب ، لحل أعداد الخلايا الفردية و / أو morphologies في مجموعات كبيرة وcomingled إلى "تسليط الضوء على" مناطق المحتوى الأغشية عالية ، مثل neuropils متشابك. للتصوير في مراحل اليرقات في وقت متأخر ، فإنه من المفيد استخلاص / عبر خطوط المعدلة وراثيا في الخلفيات الطافرة التي تقلل تصبغ [على سبيل المثال ، روي [أربيسن (روي) أو روي [أربيسن] ؛ البيضاء (روي ؛ الرداء) ، 4]. في تجربتنا ، والحد من iridiphores (على سبيل المثال ، روي) هي القضية الأكثر أهمية ، ويمكن معالجتها كيميائيا باستخدام استحداث الميلانين 1 – 2 – فينيل ثيوريا (PTU) أو مع المسوخ "البيضاء" التي تفتقر melanophores. ومع ذلك نلاحظ ان رينيه وآخرون 4 ، أظهرت العجز البصري والتغيرات المورفولوجية متواضعة في شبكية العين من الأسماك التي تفتقر melanaphores ، وعلى ضوء ذلك يمكن أن تحدث وفاة مكثفة مبصرة في المسوخ "البيضاء". وبالتالي ، فإن هذه القضايا تحتاج إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار عند تصميم تجارب التصوير و / أو تفسير البيانات. لهذه التظاهرة ، كانت خطوط الأسماك المعدلة وراثيا ومتحولة المستخدمة : TG (NYX : Gal4 – VP16) q16a / + ؛ تيراغرام (UAS : gap43 – YFP) q16b / + ؛ تيراغرام (UAS – E1b : NfsB – mCherry) c264 / + ؛ تيراغرام (pax6 – DF4 : gap43 – CFP) q01 / + ؛ روي a9/a9 ملاحظة : في الأسماك "1" ، وهو من subpopulation NYX – المروج تعريف الخلايا الشبكية القطبين أعرب عن غشاء الموسومة YFP و / أو مراسل الانصهار NTR – mCherry (معظم التعبير عن كليهما) ، وتقريبا جميع خلايا الشبكية تعبير عن CFP الأغشية المفتاحية . الأسماك "2" أعلاه فيما عدا الخلايا الدبقية مولر أعرب عن GFP عصاري خلوي ، ويتم التخلص العالمية التعبير CFP الشبكية. تعبير عن الانصهار NTR – mCherry يجعل الخلايا القطبين NYX محددة عرضة للدواء مساعد بفعل الاجتثاث 3،5. 2. اختيار وتحضير الأجنة / اليرقات للتصوير لايف لم المعدلة وراثيا / خطوط متحولة من الفائدة ، وجمع البيض واحتضان / الحفاظ على 28،5 درجة مئوية في حل 0.3X Danieau (أو "متوسطة الجنين" من خيار). إن لم يكن في الخلفية "ألبينو" ، ينبغي أن تضاف لتثبيط نشاط PTU التيروزينات قبل أي دليل على تصبغ في أنسجة الفائدة (على سبيل المثال ، ~ 16 HPF للعين ، و 200 ميكرومتر النهائي). علما أن العلاج PTU بتركيزات تزيد عن 75 ميكرومتر قد يسبب السمية و / أو تأثيرات ماسخة. ومع ذلك ، لأن العين لذوي البشرة شديدة وعلاجات أقل من 200 ميكرومتر ليست كافية لتصوير مبائر عالية الدقة ، في ظل هذه الظروف من المهم تحديد صحة الأسماك يبحث عن التصوير. لأنسجة التصوير الأخرى ، قد PTU 75 ميكرومتر يكون من الأفضل. أيضا ، كما ذكر أعلاه ، واستخدام خطوط "ألبينو" متحولة يغني عن الحاجة لعلاج الأجنة مع وPTU هو الاستراتيجية المفضلة للتصوير في مراحل اليرقات في وقت متأخر. مرة واحدة واضحة للصحفيين الفلورسنت فرز الأسماك ، وفقا لتعبير التحوير والصحة العامة باستخدام المجهر مضان التكبير ستيريو أو ما شابه ذلك. قبل اليوم الأول من التصوير ، وتذوب ذوبان agarose منخفضة (LMA) في المتوسط ​​الجنين إلى التركيز النهائي من 0.5 ٪ والحرارة ومزيج مخزن للوصول الى حل في 40 درجة مئوية. في اليوم الأول من التصوير ، وإعداد حل تصاعد : إضافة tricaine (مخدر ، 756 ميكرومتر النهائي) وPTU (إذا لزم الأمر) لLMA 0.5 ٪ في المتوسط ​​الجنين ، مزيج بلطف ، وتعود إلى 40 درجة مئوية. تخدير الأسماك في المتوسط ​​عن طريق نقل الجنين تحتوي على PTU و / أو tricaine ، إتاحة الوقت للأسماك لتصبح غير مستجيبة للمس (~ 3 دقائق). نقل الأسماك الفردية في حل المتصاعدة ، مع الحرص على عدم تمييع agarose بحيث يمكن إعادة استخدامها. نستخدم micropipette مع تلميح قلص لنقل ، وهذا يساعد أيضا على الحفاظ على وحدة للرقابة (~ 30 ميكرولتر). بعد الحصول ، عكس ماصة والسماح الأسماك تترسب في القاع بحيث يلامس طرف إلى حل يسمح بنقل خطورة متصاعدة من دون الحاجة إلى تبديد أي السائل. بعد نقل ، وطرد من حل مخدر micropipette واستخدامه لنقل الأسماك في قطيرة 30 ~ ميكرولتر من محلول متزايدة لطبق بيتري. ملاحظة : هذه الطريقة الوحيدة ذات الصلة التركيب المجهري لتستقيم حيث سيتم استخدام العامل أهداف طويلة المسافة الغمر بالمياه. بالنسبة ليthods ذات الصلة المجاهر المقلوب ، حيث هناك حاجة coverslips ، انظر أندرسون وآخرون ، 2010 ؛ اوبراين وآخرون ، 2009 ؛. Graeden وSIVE 2009. عودة الحل المتصاعدة إلى 40 درجة مئوية كتلة التدفئة. باستخدام فرشاة رموش العين أو ما شابه ذلك تدوير السمك بلطف في اتجاه المطلوب والموقف في المنطقة من اهتمام في وسط الحبرية agarose. كرر الخطوات من 6 إلى 10 لتحميل العدد المرغوب فيه من الأجنة في الطبق. للتجارب مرور الزمن التسلسلي (أنظر أدناه) ونحن عادة ما يشن ست أسماك في وقت ومحاولة للحد من جلسات التصوير إلى 1 ساعة لكل مجموعة. في حين أن الأسماك الأخرى المتصاعدة التحقق مرة أخرى للتأكد من المحافظة على الموضوعات السابقة التوجه المطلوب حتى يتصلب agarose (~ 3 دقائق). وقد عززت agarose بعد ، نقل الأسماك إلى مرحلة المجهر مبائر وإضافة بلطف المتوسطة الجنين تحتوي على PTU و / أو tricaine إلى الطبق حتى يتم مغمورة تماما عن الأسماك. 3. "متعددة الألوان" في الجسم الحي التصوير متحد البؤر ملاحظة : لقد حاولت تعميم البروتوكول أدناه بحيث يوفر المعلومات ذات الصلة من أجل تكوينات المجهر الأخرى. إشارات محددة إلى أوليمبوس والتطبيقات البرمجية ImageJ في الاقتباس. نظامنا هو التصوير FV1000 أوليمبوس المجهر مبائر تستقيم مجهزة 405 ، 440 ، 488 ، 515 ، 559 ، 635 نانومتر ، والليزر ، وهما متغير قنوات حاجز الكشف تصفية (السماح ضبط إعدادات الطول الموجي الانبعاثات بزيادات نانومتر 1) ، واحدة حاجز القياسية تبث قناة مرشح (للأحمر والتصوير الحمراء بعيدة) ، وقناة واحدة الخفيفة. فتح برامج التصوير ("ASW – FV10") واستخدام مصادر الضوء المرسل أو الفلورسنت لتحديد موقع المنطقة من الفائدة. الأمثل للتصوير و / أو الخلوية الجزيئية استخدام بالتفصيل أهداف لمسافات طويلة في العمل مع NA عالية (على سبيل المثال ، 60X ، 1.2NA). إذا جمع الصور المنقولة الضوء ، والتركيز على الحجاب الحاجز المجال لإنارة كولر. fluorphores اختيار المناسب من قائمة "داي" أو تحميل المعلمات اقتناء صورة من ملف محفوظ مسبقا. إجراء تعديلات على نطاقات الانبعاثات ("إعداد الطيفي") الضرورية لفصل الإشارات مراسل نظيفة و / أو إشارة إلى نسب الضوضاء القصوى. هذه الإعدادات سوف تحتاج إلى تعريف لكل تجربة تجريبيا لتقليل التشويش ولكن تعظيم إشارة ؛ تظهر إعدادات الأمثلة المقدمة هنا أدناه : Flourphores الليزر (نانومتر) إعدادات الجدار / الانبعاث تصفية (نانومتر) 1) ECFP ، EYFP ، mCherry * 440 ، 515 ، 559 * 460-500 ، 530-545 ، 575-675 2) EGFP ، ** ** EYFP ، mCherry 488 ، 515 ، 559 500-515 ، 530-545 ، 575-675 ويمكن تحسين * تصوير mCherry باستخدام الليزر الطول الموجي العالي (على سبيل المثال ، 568 أو 594 نانومتر) ** مطلوب وضع التصوير متسلسلة تسمح مزدوج اللون المرآة والحاجز التغييرات تصفية ("القنوات الظاهرية") بسبب الانبعاثات / التداخل بين الإثارة وYFP GFP. يمكن تعيين وGFP mCherry لقناة واحدة ، YFP إلى قناة منفصلة. ملاحظة : الحديث المتبادل بين GFP والصور YFP سوف يكون واضحا قبل الطرح صورة (الجزء 6). تأكد من تحديد الهدف المستخدمة في القائمة المنسدلة لضمان أي برنامج يتم تعديل تعريف المسبقة بشكل صحيح. لتركيز أشعة الليزر ومستويات الطاقة المحددة ، حدد بحث عن الجدول (طرفية) أن يكشف عن التشبع بكسل ("مرحبا ، لو") لكل قناة. مجموعة الحساسية للكشف عن ("عالي" ، PMT الجهد) إلى قيمة الجودة بما يتفق مع الصورة المطلوبة (معرفة تجريبية) ورفع الانتاج تدريجيا حتى كثافة الليزر صورة مقبولة تجنب التشبع بكسل. تحقق من الحديث المتبادل بين القنوات ، وضمان أن كل سطر تنتج ليزر يمكن كشفها إلا في إشارة القناة المناسبة التي تحول يدويا ليزر وإيقاف في حين رصد جميع قنوات التصوير. الحديث المتبادل للقضاء على تقليل قوة الليزر. إذا لم يكن الحديث المتبادل هو واضح ، يمكن الحصول على جميع القنوات في وقت واحد توفير الوقت وفورات كبيرة. في حال الحديث المتبادل لا يمكن تجنبه ، واستخدام "التسلسلي" واسطة التصوير التي التبديل بين الليزر / قنوات منفردة. الحالات المتطرفة (مثل التصوير وYFP GFP) تتطلب استخدام وسائط متتابعة أيضا التبديل المرايا مزدوج اللون و / أو مرشحات حاجز ("القنوات الظاهرية"). ملاحظة : هذا الخيار يقدم التأخير الزمني كبيرا في عملية اقتناء الصور وربما لا تكون أبpropriate لالتقاط عمليات ديناميكية للغاية. ويمكن استخدام "تكبير" و "التناوب" وظائف أخرى لتأطير مجال الفائدة. ويمكن أيضا أن تستخدم لتكبير تحسين دقة الصورة ، وتصل إلى حدود الشكل موضوعية والمسح الضوئي المستخدمة (على سبيل المثال ، 512 × 512 ؛ للحصول على معلومات حول هذه القضايا انظر ، http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . PDF). في الجسم الحي عن التصوير بشكل عام ، وذات أهمية خاصة بالنسبة لمرور الزمن والتصوير ، والتقنيات التي تقلل من القضايا الضيائية (أي تراكم الجذور الحرة) في حاجة إلى التأكيد ؛ سرعات مسح سريع (على سبيل المثال ، 2 ميكرو ثانية / بكسل) ، وانخفاض انتاج الليزر وينبغي استخدام المستويات (على سبيل المثال ، 1 ٪) كلما كان ذلك ممكنا ، وكذلك الفحص أدنى القرار تنسيق كاف لالتقاط المعلومات البارزة. لتحسين دقة الصورة ، والمسح الضوئي في المتوسط ​​("كالمان") يمكن استخدامها خلال الاستحواذ. بسرعة أبطأ المسح أيضا إلى تحسين القرار ولكن الليزر زيادة مدة بقاء ، والتي سوف تؤدي إلى تفاقم الضيائية وقضايا التبييض. علما أن كلا من هذين النهجين ليست مثالية لمرور الوقت نظرا لاحتمال عدم القدرة على التقاط التغيرات السريعة عبر سلسلة ض ، وهي ظاهرة نسميه "طمس الوقت". علما بأن المتوسط ​​من خلال خط مقابل من جانب الإطار يمكن أن يساعد في القضاء على "الوقت طمس" القضايا داخل طائرة واحدة ولكن ليس عبر Z – الأعماق. يمكن استخدامها إذا كانت شدة إشارة منخفضة وغير مطلوب أقصى دقة الصورة (على سبيل المثال ، ببساطة عد الأرقام الخلية) ، وزيادة مبائر الفتحة (الثقب قطر) لتعزيز الإشارات. هذا يساعد على إبقاء الليزر منخفض الكثافة ، والحد من الضيائية والتبييض ، ولكن ضبط الفتحة إلى قيمة أكبر من 1 وحدة مهواة يؤدي إلى خسائر سريعة في جودة الصورة. تحديد أبعاد ض متعمقة باستخدام وضع المسح السريع ("التركيز X4"). بسبب انخفاض كثافة إشارة عموما مع ض متعمقة فمن الأفضل أن تبدأ ض المكدس اقتناء بأقل عمق سطحي وتنتهي عند أكثر ، وهذا يسمح اكتسب إشارات أكثر صعوبة كبيرة قبل أن تبيض يحدث. فحص للكشف عن إشارة كافية في جميع أنحاء عمق الصورة. إذا رغبت في ذلك ، يمكن استخدام تصحيح السطوع ض البعد الدالة ("Z برايت") لضبط معايير الحصول على الصور في أعماق المحدد. تعيين حجم الخطوة ض البعد التجريبي وفقا للاحتياجات. على سبيل المثال ، في مثالنا الأول (الشكل 1) كنا مع مجرد "تعداد الخلية في شبكية العين خلال الأيام المتعاقبة الفردية ، وبالتالي فإننا تعيين ض متعمقة إلى 15 ميكرون ، واتخذت 5-7 الصور في كل شبكية العين. سمحت لنا هذه الاستراتيجية لعينة كل الشبكية مع عدم وجود تداخل بين الصور الخلوية. في مثالنا الثاني (الشكل 2) ، أجرينا السريع 4D الوقت الفاصل بين الأفلام التي GFP وmCherry الإشارات اللازمة لتكون مرتبطة مكانيا ، وبالتالي يمكننا تحديد حجم الخطوة إلى ثلاث مرات الوحشي القرار حلا وسطا النظرية التي سمحت ض المكدس الصور التي يتعين اتخاذها في كل 5-10 دقائق ولكن لا يزال يخدم في حل التفاصيل الخلوية الفردية. الحصول على صور ("XYLZt") وحفظها. الانتقال إلى الأسماك القادمة إذا المنفذ التسلسلي الوقت الفاصل بين تجربة (انظر رقم 4 أدناه). لسرعة الوقت الفاصل بين التصوير انظر # 5 أدناه. 4. المسلسل 'الصيد والإصدار" التصوير : طريقة لتتبع التغيرات الخلوية في الأسماك الفردية خلال الأيام المتعاقبة أ "والافراج عن الصيد" يستخدم بروتوكول لتقليل كمية من الأسماك ويجمد الوقت وزيادة عدد الأسماك في تصوير التجربة. وتقتصر فائدة هذه التقنية في العمليات البيولوجية التي تتكشف خلال الأيام (على سبيل المثال ، Mumm وآخرون 2006 2). ميزة واحدة لهذا النهج هو أنه يتيح لوحظ أن أية تغييرات يمكن السيطرة عليها داخليا ، أي مقارنات بين الدول المختلفة للأفراد وليس عبر السكان. لا يمكن أن يؤديها على سبيل المثال ، تتبع التغيرات في عدد الخلايا المسماة موجودة في نسيج معين بدقة حتى لو كان عدد الخلايا المسماة البداية اختلافا كبيرا بين الأسماك الفردية. يتم توفير وسائل لاستخدام هذا البروتوكول ضمن سياق فحص الخلايا التي يسببها دواء مساعد الاجتثاث 3،5 هنا. لتصور الاجتثاث وتجديدها من أنواع الخلايا المستهدفة في الأسماك الفردية على مر الزمن ، واكتسبت الصور مبائر قبل الادارة دواء مساعد (ما قبل العلاج) ، وذلك مباشرة بعد إزالة دواء مساعد (بعد العلاج) وخلال فترة النقاهة (صور الاسترداد). هي التي شنت الأسماك والمصورة على النحو الوارد أعلاه : المعالجة المسبقة التصوير. مرة واحدة وقد تم تصوير الأسماك يتم اطلاق سراحهم في المتوسط ​​الجنين (+ دواء مساعد) وحضنت في 28.5 درجة مئوية حتى الدورة التصوير ما بعد المعالجة. يعملون في فرق من اثنين ، واحد والإفراج عن تصاعد الأسماك ، وغيرها من التصوير هو وسيلة جيدة لزيادة عدد الأسماك التي يمكن تصويرها في اليوم الواحد. بعد تصوير جميع السمك في طبق واحد يحل محل المتوسطة الجنين تحتوي على tricaine مع الجنين المتوسطة وحدها (+ / — PTU). للافراج عن الأسماك ، واستخدام ملقط لقطع المجوهرات من خلال agarose على كلا الجانبين من اليرقات ثم ندف agarose بلطف بعيدا حتى الأسماك تعوم بحرية في المتوسط ​​الجنين. دواء مساعد بفعل الاجتثاث : نقل اليرقات داخل الفرد بشكل جيد من لوحة تحتوي على multiwell المتوسطة الجنين (+ / — PTU) + دواء مساعد (مثلا 10MM ميترونيدازول ، MTZ). لضمان الدقة في تركيزات دواء مساعد النهائي نحن عادة قسامة حجم محدد من الجنين المتوسطة (+ / — PTU) التي تحتوي على تركيز 2X من دواء مساعد (على سبيل المثال ، 20 ملم) في كل بئر. ثم تضاف الأسماك إلى الآبار في حجم مساو من المتوسط ​​الجنين (+ / — PTU) لتحقيق تركيز دواء مساعد النهائي ل1X. في احتضان 28.5 درجة مئوية حتى يمكن التحقق من الاجتثاث استهدفت خلية. ملاحظة : دواء مساعد العلاجية اللازمة لتحقيق النجاح التذرية تختلف تبعا لنوع الخلايا المستهدفة ؛ تركيز دواء مساعد ومدة العلاج سوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا ، أن ندرك أن تركيزات عالية السمية تسبب العامة ، على سبيل المثال ،> 10 ملي MTZ. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للإشارات perdurance مراسل مجزأة تعقيد المقررة للنجاح التذرية ، في بعض الحالات هو مطلوب مبائر المجهري لتصور كاف فقدان الخلية. بعد المعالجة التصوير : هي التي شنت هذه الأسماك التي النسيج نفسه هو التوجه الأمثل وتصويرها على النحو الوارد أعلاه. مرة واحدة وقد تم تصوير جميع الأسماك على طبق معين يتم اطلاق سراحهم في المتوسط ​​الجنين (+ / — PTU) في الآبار الفردية (كما سبق) وحضنت في 28.5 درجة مئوية للسماح للتجديد نوع من الخلايا ablated. تبعا لعمر الأسماك والوقت اللازم لتحقيق الانتعاش قد يكون من الضروري لإطعام الأسماك أثناء هذه المرحلة من الفحص. نستخدم الغذاء يعيش مثل الروتيفر متناعلات أو لضمان بقاء الأمثل. ومن المستحسن أيضا لتوفير وسائل الاعلام العذبة يوميا ، وخصوصا اذا تمسك السمك بكميات منخفضة (على سبيل المثال ، 96 لوحات أيضا). انتعاش التصوير : لتوثيق حركية استبدال الخلية ، ويمكن تصوير الأسماك على أساس يومي خلال فترة النقاهة. يمكن مرة واحدة وضعت في حركية يمكن تبسيط الفحص من خلال الحصول على الصور الانتعاش إلا في وقت نقاط الاهتمام (على سبيل المثال ، والانتعاش الكامل). الشكل 1 مثالا على هذا النهج من دراستنا لتجديد الخلايا في شبكية العين. وينبغي في ختام التجربة الأسماك يتم التخلص عن طريق الغمر في محلول 20X (15.3 ميكرون) tricaine على الجليد. 5. السريع من الزمن الفاصل بين التصوير. للتصوير مرور الزمن السريع (أي "الأفلام") من fluorphores متعددة ، والتقنيات التي تقلل قضايا حاسمة الضيائية (انظر أعلاه). كما ذكر أعلاه ، هو الأنسب لهذه التقنية تسمح fluorphores وقت واحد ، بدلا من متسلسلة ، والتصوير الحفاظ على الأسماك في 28.5 درجة مئوية باستخدام مرحلة ساخنة ، ITO عنصر تسخين الزجاج ، أو ما شابه ذلك. استخدام الأساليب التي تقلل من التبخر للمساعدة في استقرار درجة الحرارة والأسمولية (على سبيل المثال ، س الدائري coverslips مختومة لالمجاهر المقلوب). اذا كنت تستخدم أكثر من مرة اقتناء الآلي الموسعة تأكد من تعيين حجم مكدس للسماح للنمو و / أو الانجراف في Z – البعد. تعيين فترات زمنية ، وعدد من عمليات التفحص ("TimeScan" أو "TimeController"). ومعدلات حيازة هناك حاجة إلى إنشاء تجريبيا وفقا لديناميات العملية البيولوجية تصوير و / أو تعديلها وفقا لخصائص الحساسية الضوئية من السكان خلية من الفائدة. الحصول على صور ("XYLZt" الزر) وحفظها. لبناء "الأفلام" ، والمجالات ذات الاهتمام تحتاج إلى تعريف والانحياز في X ، Y ، Z وأبعادها. عملية الكامل هو خارج نطاق هذا البروتوكول ولكن استعراض البرامج التي تتوفر العديد من تيسر أيضا التكبير ، والتناوب ، ووظائف بالغسل خلال 4D صورة التجمع (Volocity ، أميرة ، الخ). 6. الطيفي معالجة الصور باستخدام الفاصل Imagej مجانية على النحو الأمثل ، عند إجراء التصوير الصحفي متعددة التجربة أنه من الأفضل استخدام fluorphores التي تكون مفصولة جيدا طيفيا. ومع ذلك ، هذا ليس من العملي دائما و / أو غير ممكنة. هنا نقدم طريقة مبسطة لفصل fluorphores التي تداخل ملامح الإثارة وانبعاث ، في هذه القضية وYFP GFP. في المثال المقدمة ، وقد استخدمنا تقنيات التصوير الوقت الفاصل بين المذكورة أعلاه لتتبع سلوك GFP المسمى الشبكية "الخلايا الجذعية" ، مولر الدبقية ، وخلال استهداف والاجتثاث تجديد خلايا الشبكية المسمى مع القطبين YFP وNTR – mCherry (الشكل 2). جمع الصور باستخدام وسائط التصوير متسلسلة والمرشحات التي تسمح حاجز متغير يتم الحصول عليها بصورة مستقلة ومتداخلة fluorophores فصل جزئيا ، على التوالي (انظر أعلاه على سبيل المثال ضبط GFP / YFP). لإزالة التشويش نستخدم استراتيجية بسيطة الطرح الصورة التي يزيل إحدى القنوات إشارة من آخر. صورة عملية الطرح : تركيبل الإصدار الأحدث من ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html) ، الامكنه بيو تنسيقات أداة (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) ومحاذاتها المداخن في المكونات (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html). استخدام الامكنه بيو تنسيقات استيراد المكونات في فتح ملفات الصور ، ببساطة سحب الملف من الفائدة على نافذة ImageJ ستبدأ أداة الاستيراد. تقسيم القنوات الى مداخن الفردية باستخدام "قنوات سبليت" مربع في إطار استيراد أو "القنوات سبليت" تحت علامة التبويب "أدوات قناة" (التحول + CTRL + Z) بعد التحميل. بدء محاذاة 3 TP المساعد (الإضافات> محاذاة مداخن> محاذاة 3 TP). الكدسات تحتاج إلى الانحياز لضمان الطرح السليم. حدد مرجع المكدس في مربع القائمة المنسدلة الأولى والمكدس خطاء الانحياز في الثانية. تحقق "س ص الأصل استخدام نسبي" و "استخدام z النسبية المنشأ" مربعات وانقر على زر "موافق". لبدء عملية محاذاة ، انقر فوق "تسجيل وحدة التخزين" الزر. سوف تظهر نافذة جديدة تحتوي على المعلمات المحاذاة. وقد تم تحسين هذا القسم من قبل الموزع من البرنامج المساعد ، وأية تعديلات ضرورية ، ببساطة انقر على "موافق". عند الانتهاء ، سيكون على "الانحياز الأكوام" نافذة تظهر. حدد "إخراج" من نافذة محاذاة ويبدو أن إطار الإخراج. كما تم تحسين هذا الإطار وليس بحاجة إلى تعديل. انقر على زر "موافق". وينبغي أن يكون مكدس جديدة تظهر في مساحة العمل مع "الانحياز" إلحاق إلى نهاية عنوان الملف. سيتم إزالة التشويش باستخدام "آلة حاسبة صورة" (عملية حاسبة صورة>). حدد المكدس لتطرح في مربع القائمة المنسدلة Image1 وكومة المستخدمة في الطرح في مربع القائمة المنسدلة Image2. حدد "طرح" في مربع عملية المنسدلة وانقر على "موافق". وسوف يطلب ImageJ عملية مكدس ، حدد "نعم". وينبغي أن تظهر كومة الجديدة التي أبعدت الحديث المتبادل بين القنوات المتداخلة. لإعادة بناء الصورة نفسها قبل المحاذاة والطرح الأكوام يجب أن يتم دمجها. حدد "قنوات دمج" في إطار أدوات القناة. وسوف تسمح لك أداة لدمج ما يصل إلى أربع مداخن الى hyperstack. ملاحظة : لدمج أكثر من 4 المداخن ، مداخن سلسلة بالترتيب المطلوب باستخدام أداة سلسلة (صور> مداخن> أدوات> سلسلة). تحويل المكدس متسلسلة لhyperstack (الصور> مكدس> hyperstack لhyperstack). سلسلة من المداخن عمق التغييرات ، والوقت ، لكي قناة (zct) ، وهذا يحتاج إلى إعادة تعيين ضمن مربع القائمة المنسدلة التي تظهر ، تعيين "النظام" لxyztc ، تعيين "قنوات" ، "شرائح" و "إطارات" وفقا ل عدد من المداخن ، وعمق المكدس ، وعدد من النقاط الزمنية ، على التوالي.. أخيرا ، فإن جميع القنوات تحتاج إلى الملونة ، ويعدل عن السطوع والتباين ، وحفظها في ملفات TIFF. من هنا ، وتحويلها إلى RGB ، المونتاج ، ض الإسقاط ، أو سلسلة الوقت هو نفس العملية بالنسبة للملفات الأصلي. 7. ممثل النتائج الشكل 1. سلسلة الوقت الفاصل بين الصور مبائر يتظاهرون خسارة المستهدفة وتجديد NTR – mCherry معربا عن خلايا الشبكية الثنائي القطب (خلايا الدم الحمراء). A & 'A) وقبل العلاج هناك فسيفساء من التعبير غشاء الموسومة مراسل YFP في خلايا" السيطرة "بين القطبين ، كما هو موضح باللون الأصفر ، والكرز ، nitroreductase انصهار بروتين في bipolars" المستهدفة "تظهر باللون الأحمر. B & B ') وبعد العلاج مع الأحمر ، معربا عن الخلايا nitroreductase القطبين ، تضيع ، في حين أن يدخر الخلايا الصفراء" السيطرة "بين القطبين. ، ميترونيدازول هذا يدل على الطبيعة المحددة للغاية من هذه المنهجية الاجتثاث. ) C & C "عندما تتم إزالة ميترونيدازول ، NTR – معربا عن عودة الخلايا (الحمراء). الشكل 2. مثالا للصورة عملية الطرح الذي يسمح GFP وYFP فصل نظيفة اقتناء التالية. يتم محاذاة A & A ') قبل الطرح ، وGFP (الخضراء) وYFP (pseudocolored الأرجواني) الصور. B & B ') عملية الطرح يسمح YFP إزالة الخلايا التي تحمل علامات القطبين من الصورة GFP ، مما يسمح GFP المسمى الدبقية مولر أكثر سهولة الكشف عنها. C & C ') المشاركة في التعبير عن GFP (الخضراء) وmCherry (أحمر) هو واضح في الخلية المشار إليها بواسطة السهم. لأن المشارك التعبير عن الخلية الدبقية مولر علامة وعلامة القطبين الخلية توحي بأن خلية التذرية القطبين مشغلات مولر الدبقية لتحل محل الخلايا المفقودة. هذا التفسير يتماشى مع دراسات حديثة للتجديد الشبكية التي توريط الدبقية مولر باسم "الخلايا الجذعية" الإصابات التي يسببها في كل من الثدييات والأسماك.