Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

1. Preparación DII / tungsteno Balas bolas: DII (1-1'-dioctadecil-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato) balas deben estar preparados antes de cortar rodajas de cerebro. El procedimiento tarda aproximadamente 2-4 horas, dependiendo de cuántas balas se preparan a la vez. Si a partir de un nuevo lote de bolas de tungsteno, preparar alícuotas de 300 mg cada uno. Las alícuotas son preparados por la suspensión de 6 gramos de tungsteno en 2 ml de cloruro de metileno. Luego, pipeta de 100 l de solución de cordón en tubos de microcentrífuga para producir alícuotas de 300 mg de tungsteno cuentas alícuotas Conservar a temperatura ambiente (Nota: cloruro de metileno se evapora muy rápidamente el alcohol también se puede utilizar para minimizar la evaporación.)… Cuando a partir de alícuotas de cuentas, resuspender cada alícuota (300 bolas de tungsteno mg) en 300 l de cloruro de metileno y cubrir rápidamente para evitar la evaporación. Esta cantidad es suficiente para 3 lotes de balas. Prepare una solución de tinte pesando 13,5 mg de DII tinte lipofílica y la adición de 450 l de cloruro de metileno (concentración final = 3mg/100μl). Escudo de la cuentas con el tinte. Coloque una placa de vidrio sobre un pedazo de cera recubierta de papel y un peso Pipetear 100 L de cuentas en la diapositiva. Añadir 100 ml de la solución de DII, mezclar bien con punta de la pipeta, y secar al aire hasta que gotas a su vez de color gris claro. Use una hoja de afeitar para raspar cuentas de la lámina de vidrio y los dados de las cuentas en un polvo fino (Nota: utilice un disco nuevo, si hace más de un color de balas a fin de no contaminar los colorantes).. Cuentas de raspar en el pesaje cuentas de papel y el embudo en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 3 ml de agua y de ultrasonidos en baño de agua durante 10-30 minutos a temperatura ambiente (Nota: dados de polvo y ultrasonidos se aplican para reducir al mínimo la formación de grupos de bolas recubiertas que interrumpir el etiquetado escaso de neuronas individuales).. 2. Preparación de polivinilpirrolidona (PVP) y el tubo de la solución: Para mejorar el agarre del talón a la tubería de bala (tubos TEZFEL), cubrir con polivinilpirrolidona (PVP) solución. Prepare 10 ml de solución de PVP en agua a una concentración de 10 mg de PVP / ml. Use una jeringa de 12 ml con adaptador de tubos (tubo flexible con un diámetro ligeramente más grande) para pasar la solución de PVP a través del tubo de bala y luego lo expulsan por el otro extremo. Reutilización de la solución a un tubo de más abrigo bala si varios lotes se preparan de forma simultánea. Desechar la solución PVP después de su uso. Para agregar las cuentas de la tubería de bala, vórtice de las cuentas para producir una solución homogénea y el uso de la jeringa para extraer la solución de cuentas a través de la tubería para que las cuentas se distribuyen uniformemente a lo largo de la tubería. ((Nota:) tratar de minimizar el número de burbujas de aire en la tubería). Colocando la manguera a través de la estación de la preparación y permitir que las cuentas que saldar. Use la jeringa para extraer con cuidado el agua de manera que sólo las cuentas siguen siendo. Girar el tubo en la estación de la preparación y seco con gas de nitrógeno hasta que las gotas de agua ya no son visibles. Este paso dura aproximadamente 10-20 minutos. Cortar las balas con cortador de tubo en 13 mm de longitud y el lugar en viales de centelleo que contienen Drierite o algún tipo de sulfato de calcio anhidro. Envuelva en papel de viales para protegerlo de la luz. 3. La tinción DII: Esta técnica se puede utilizar el etiquetado para teñir las neuronas en el tejido cerebral de diversas especies, en este caso particular, de ratón (3-6 meses de edad) y los primates no humanos (9-15 años). Es preferible que los cortes son preparados a partir de tejido cerebral de perfusión fijo obtenido por transcardiaca de solución fijadora por la preservación del tejido que se espera ser el mejor en esta situación. Sin embargo, la fijación por perfusión no siempre es posible (como fue el caso de los tejidos de mono) y el etiquetado DiOLISTIC todavía puede ser aplicado con éxito en diferentes procedimientos para la preparación del tejido. Aquí se describen tres procedimientos diferentes para la preparación del tejido: Fix cerebral de perfusión cerebral transcardiaca → → eliminar postfix durante 10 minutos → → rebanada cortada mancha Quitar el cerebro → bloque de corte de tejido → → bloque fijar en el segmento de lavado PBS corte → → mancha Quitar el cerebro → → rebanadas cortadas fijar → → lavar la mancha En el presente estudio, los cerebros de los monos se obtuvieron de los sujetos que fueron perfundidos con helada transcardially artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF) antes de la cosecha del cerebro y un bloque (4 mm de espesor) de tejido que contiene el núcleo caudado unaª putamen se fijó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Para todos los procedimientos, solución fijadora contiene paraformaldehído al 4% y 4% de sacarosa en PBS (preparados frescos o utilizarse dentro de 15 días). Es importante tener en cuenta que los tiempos de fijación son críticas para la tinción de éxito. Overfixation puede afectar a la tinción mediante la interrupción de la integridad de la membrana plasmática y causando tinte se salga de la celda (ver más información en los resultados). Para el procedimiento A y B, rebanadas (200μm) se cortan de cerebro fijo o bloque de tejido y las rodajas de colocar en 24 y la placa con PBS. Para el procedimiento de c, frescas rebanadas cerebral agudo (200 m) se cortan con un vibratome en una solución de corte en frío que contiene (en mM) 110 de colina-Cl, 25 de NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 de MgCl 2, 25 glucosa, ácido ascórbico, 11,6, 3,1 ácido pirúvico (osmolaridad = 310 mOsmols) e inmediatamente después de las rebanadas se colocan en placas de 24 pocillos y se fija durante 30 minutos con solución fijadora a temperatura ambiente. Lavar las rodajas con PBS, 3 veces. Antes de rebanadas de rodaje, retire la PBS a partir de los pozos y, con un pincel, coloque la rebanada en el centro del pozo. Dispara balas de DII a través de 3,0 micras de papel de filtro utilizando un sistema de Gene Helios pistola a 120-180 psi de presión de gas de helio, colocando la pistola a una distancia de 1,5 cm entre la muestra y el extremo del cañón. (Nota importante:. Neuronas sólo dentro de los 50 mm de la superficie de corte será etiquetado por este método, por lo que es importante mantener el mismo lado de la corte hacia arriba durante el lavado y para el montaje De esta manera, usted se asegurará de que el neuronas marcadas estará dentro de la distancia focal cuando se generan imágenes con un microscopio confocal). Lávese las rebanadas con PBS 3 veces y almacenarlos en PBS durante varias horas para permitir que el DII para difundir a lo largo de las dendritas. Monte rodajas sobre un portaobjetos de vidrio con prolongar Antifade oro y cubrir con un 18×18 mm N º 1 cubreobjetos. (Nota: Para el Procedimiento C, lo mejor es montar las rebanadas en el mismo día de la integridad de los cortes no se mantiene bien durante la noche). Sellar con esmalte de uñas transparente después de que medios de montaje se ha secado. Por otra parte, los cortes se pueden teñir con anticuerpos antes de montar como se describe a continuación. (Nota: Las diapositivas se pueden utilizar por lo menos 6 meses a un año si se almacena en la oscuridad a 4 ° C. DII es sensible a la luz la exposición a largo plazo a la luz hará que la mancha se descolora). 4. La tinción de anticuerpos: La inmunotinción se debe realizar después del paso 3.4 y antes de montar. Permeabilización: rodajas de incubación en 0,01% Triton X-100 en solución de PBS por 15 min a temperatura ambiente (300-500 l por pocillo). NOTA: No utilizar concentraciones más altas de detergente, ya que se disuelven DII y reducir significativamente la tinción fluorescente. Trate de minimizar el tiempo de detergente incubaciones amplia también reducirá el etiquetado DII. Si incubación prolongado es necesario, mantener cortes en PBS en lugar de en solución de bloqueo. Bloqueo: Incubar las rebanadas en la solución de bloqueo con 10% suero de cabra, el 0,01% de Triton X-100 en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Anticuerpo primario: Añadir anticuerpo a la dilución deseada en solución de bloqueo (por ejemplo, de conejo anti-GFP de anticuerpos en la dilución 1:1000). Añadir 300-500 l por pocillo e incubar durante 1-2 horas. (Nota: si incubaciones durante la noche es necesario, eliminar el detergente de la solución de bloqueo). Lávese las rebanadas con PBS durante 5 a 15 minutos, 3 veces. Anticuerpo secundario: Se incuba con el anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare una solución de anticuerpo secundario a la dilución deseada en solución de bloqueo (por ejemplo, Alexa-Fluor 488 anticuerpo conjugado en la dilución 1:1000). Lávese las rebanadas con PBS durante 5-15 minutos, 4 veces. Monte rebanadas de diapositivas con prolongar Antifade oro y cubrir con un 18×18 mm N º 1 cubreobjetos. Sellado con laca de uñas después de que medios de montaje se ha secado. 5. Los resultados representativos: Comprobación de la adecuación del etiquetado: la sección se puede visualizar en un ámbito fluorescentes disección equipado con una lámpara de mercurio y rojo cubo fluorescente filtro para confirmar el etiquetado DiOLISTIC éxito. La figura 1 muestra las imágenes ejemplares de las secciones del cerebro bien etiquetados obtenido a bajo aumento. Dos características importantes a tener en cuenta son un modelo de etiquetado escasa (fig. 1A) y la capacidad de identificar los distintos componentes celulares (Figura 1B-C). </li> Solución de problemas de etiquetado DiOLISTIC: La figura 2 muestra ejemplos de las secciones en las que el etiquetado DiOLISTIC trabajado de forma incorrecta. En nuestra experiencia, hay tres causas principales para el etiquetado ineficiente: El etiquetado es demasiado escasa o densa: muy pocas células son etiquetados por sección, en un caso o muchas células se denominan prevenir el aislamiento y estudio de los elementos celulares individuales. Solución: ajustar la concentración de bolas recubiertas en la solución final que se utiliza para el recubrimiento de la tubería de bala TEFZEL (sección 1.6). Aumentar o disminuir el volumen de agua (3 ml valor inicial) se utiliza para disolver las cuentas a fin de corregir el etiquetado demasiado escasa o demasiado densa, respectivamente. Además, la baja eficiencia de etiquetado puede ser causada por menos de presión de gas óptima al disparar las bolas recubiertas en las secciones. Esta posibilidad se puede descartar, asegurándose de que el tubo de bala TEFZEL ha publicado la mayoría de las perlas recubiertas y parece claro después del disparo. De lo contrario, la presión del gas de tiro debe ser mayor. Balas mal: los grupos grandes o grupos de bolas de tungsteno recubiertas de tinte se forman durante la preparación de bala. Secciones se asemejan a los ejemplos en la Figura 2-B. Solución: hacer nuevas balas prestando especial atención a la sección 1.5 y / o extender el tiempo de tratamiento con ultrasonidos en la sección 1.6. Más de fijación: el tejido se mantiene en solución de paraformaldehído durante más tiempo que el tiempo óptimo necesario para la fijación (30 minutos de 200-300 micras secciones, 1 hora por 4 secciones mm). Esto compromete la integridad de la membrana plasmática y produce secciones etiquetadas que se parecen a los que se muestran en la Figura 2C-D en el que el etiquetado parece fuera de foco debido a la dispersión de colorante de las células. Solución: reducir el tiempo de fijación. Imagen confocal: pilas de imágenes son adquiridas mediante un microscopio confocal (Zeiss LSM 510 META), con un objetivo 20x para toda la celda y el objetivo 63x de inmersión en agua para los segmentos de las dendritas. DII se emocionó con una línea de DPS 561 nm láser y la fluorescencia verde de la secundaria de anticuerpos se emocionó con una línea de 488 nm láser. El seccionamiento óptico de la muestra de la etiqueta logra cuando mediante microscopía confocal permite, además, para el aislamiento de una sola células marcadas en la muestra. La figura 3A muestra una neurona espinosa mediana estriado del cerebro de ratón y su patrón complejo dendrita rama. Imágenes de gran aumento de dendritas de las neuronas de los roedores (Figura 3B) y primates no humanos (Figura 3C) demuestran el grado de tinción de dendritas y espinas dendríticas uso de esta técnica en ambas especies. Dendritas y sus protuberancias (espinas) aparecen bien definidos, incluso cuando se consideran la columna vertebral larga y delgada cabezas tan abundante en neuronas espinosas. Cuando se combinan con DiOLISTICS inmunotinción, imagen confocal también es útil para localizar de manera inequívoca que la mancha en el mismo plano focal y la misma celda. La Figura 4 muestra un ejemplo de la colocalización de DII etiquetado y la inmunotinción de las buenas prácticas agrarias en una sola célula. La imagen es una pila (0,7 m z-sección) obtenidos a partir de una porción del estriado de un ratón transgénico que expresa la proteína fluorescente GFP bajo el promotor del receptor de dopamina D1. Figura 1. DII etiquetado de las neuronas en secciones de cerebro de los primates no humanos. (A) Imagen bajo aumento de una porción del cerebro manchado que contiene el núcleo caudado de un mono cynomolgus etiquetado que muestra escasa de neuronas con DII. (BC) Alejado neuronas espinosas pueden ser fácilmente identificados con un alcance fluorescentes de disección. Figura 2. Etiquetado DiOLISTIC solución de problemas. (AB) rebanadas manchado de cuerpo estriado dorsal de monos (A) y el ratón (B) muestra los grupos grandes de colorante revestida de piedras y, en consecuencia, no hay elementos celulares individuales se pueden distinguir. (CD) Las imágenes que ilustran el resultado de aplicar DiOLISTIC etiquetado de las secciones que se mantuvieron en solución fijadora durante períodos prolongados de tiempo, o cuando la conservación de tejidos no en mono (C) y tejidos de ratón (D). Figura 3. Imagen confocal de neuronas espinosas del estriado medio manchadas de DII. (A), la pila de la imagen de una célula completa permite el análisis morfológico de las ramas dendríticas. (BC) Dendrite segmentos de ratón (B) y el mono (C) neuronas espinosas mostrar un etiquetado claro de las dendritas y espinas. Figura 4. La combinación de etiquetado DiOLISTIC con inmunotinción. (A) DII etiquetado <strong> medio de las neuronas espinosas del cuerpo estriado de las buenas prácticas agrarias BAC ratones transgénicos que expresan bajo el promotor del receptor de dopamina D1 (B). inmunotinción con anticuerpos anti-GFP como se describe en los métodos de adaptación de Lee et al. (2006). Mismo ámbito de la A. (C) Imagen compuesta de rojo y de fluorescencia de color verde identifica DII-etiquetados neurona como una neurona GFP-positivas.