DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

1. Vorbereitung DiI / Tungsten Perlen Bullets: DiI (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat) Kugeln sollten im Voraus von Schneid Hirnschnitten vorbereitet werden. Der Eingriff dauert etwa 2-4 Stunden, je nachdem, wie viele Kugeln auf einmal zubereitet. Wenn ausgehend von einer neuen Charge von Wolfram Perlen, bereiten Aliquots von je 300 mg. Aliquots werden durch Aussetzung 6 Gramm Wolfram in 2 ml Methylenchlorid hergestellt. Dann, um Pipette 100 ul der Bead-Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen produzieren Aliquots von 300 mg Wolfram Perlen Shop Aliquots bei Raumtemperatur (Hinweis: Methylenchlorid verdampft sehr schnell Alkohol kann auch verwendet werden, zu minimieren Verdunstung werden.)… Beim Starten von Aliquots von Perlen, resuspendieren jedem Aliquot (300 mg Wolfram Perlen) in 300 ul Methylenchlorid und Deckel schnell, um Verdunstung zu verhindern. Diese Menge reicht für 3 Chargen von Kugeln. Bereiten Farbstofflösung durch Wiegen 13,5 mg lipophiler Farbstoff DiI und das Hinzufügen von 450 ul Methylenchlorid (Endkonzentration = 3mg/100μl). Bestreichen Sie die Perlen mit Farbstoff. Legen Sie einen Objektträger aus Glas auf einem Stück Wachs beschichtete wiegen Papier und Pipette 100 ul von Perlen auf die Folie. 100 l von DiI-Lösung, mischen mit Pipettenspitze und an der Luft trocknen, bis Perlen wiederum hellgrau. Verwenden Sie eine Rasierklinge abperlt Glasobjektträger abkratzen und in Würfel schneiden die Perlen zu einem feinen Pulver (Hinweis: Verwenden Sie eine neue Klinge, wenn dadurch mehr als eine Farbe der Kugeln, so dass nicht kontaminieren Farbstoffe).. Kratzen Perlen auf der Waage Papier und Trichter Perlen in eine 15 ml konischen Rohr. 3 ml Wasser und beschallen im Wasserbad für 10-30 min bei Raumtemperatur (Hinweis: Würfeln des Pulvers und Beschallung werden angewendet, um die Bildung von Klumpen von Kügelchen, die die spärliche Beschriftung einzelner Neuronen stören wird minimiert).. 2. Vorbereitung Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Lösung und Schläuche: Um bead Bindung an die Kugel Schlauch (TEZFEL Schlauch), Mantel mit Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Lösung zu verbessern. Bereiten Sie 10 ml PVP-Lösung in Wasser bei einer Konzentration von 10 mg PVP / ml. Verwenden Sie eine 12 ml Spritze mit Schlauch-Adapter (flexible Schläuche mit etwas größerem Durchmesser), die PVP-Lösung durch die Kugel Schlauch passieren und dann vertreiben sie aus dem anderen Ende. Reuse Lösung zu beschichten mehr Kugel-Schlauch, wenn mehrere Partien gleichzeitig zubereitet werden. Discard PVP-Lösung nach dem Gebrauch. Um die Perlen, um die Kugel Schläuche, Wirbel die Perlen um eine homogene Lösung zu erzeugen und verwenden Sie die Spritze mit dem Bead-Lösung durch den Schlauch zu ziehen, so dass Perlen gleichmäßig über den Schlauch verteilt werden. ((Anmerkung:) versuchen, die Anzahl der Luftblasen in den Schlauch zu minimieren). Feed the Schlauch durch das prep Station und lassen die Perlen zu begleichen. Benutzen Sie die Spritze zur schonenden Entfernung des Wassers, so dass nur die Perlen zu bleiben. Drehen Sie das Rohr in die prep Station und trocken mit Stickstoffgas bis Wassertröpfchen nicht mehr sichtbar sind. Dieser Schritt dauert ca. 10-20 min. Cut Kugeln mit Rohrschneider in 13 mm Länge und in Szintillationsgefäße mit Drierite oder irgendeine Art von wasserfreiem Calciumsulfat. Wrap Fläschchen in Folie vor Licht zu schützen. 3. DiI Färbung: Diese Kennzeichnung Technik kann verwendet werden, um Neuronen in Hirngewebe von verschiedenen Arten gefärbt werden; in diesem besonderen Fall, von der Maus (3-6 Monate alt) und nicht-menschlichen Primaten (9-15 Jahre alt). Es ist vorzuziehen, dass Scheiben von festen Hirngewebe durch transcardiac Perfusion Fixierlösung erhalten sind bereit, weil Gewebekonservierung wird erwartet, dass am besten unter dieser Bedingung. Allerdings ist Fixierung durch Perfusion nicht immer möglich (wie es der Fall mit dem Affen Gewebe) und DiOLISTIC Kennzeichnung kann immer noch erfolgreich unter verschiedenen Verfahren für das Tissue Vorbereitung angewendet werden. Hier beschreiben wir drei verschiedene Verfahren für das Tissue Zubereitung: Fix Gehirn durch transcardiac Perfusion → entfernen Gehirn → postfix für 10 min → Anschnitt → Fleck Entfernen Gehirn → geschnitten Block von Gewebe → fix Block → waschen in PBS → Anschnitt → Fleck Entfernen Gehirn → geschnittenen Scheiben → fix → waschen → Fleck In der vorliegenden Studie wurden die Affen Gehirne von Probanden, die transkardial mit eiskaltem künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) vor Gehirns Ernte und einem Block (4 mm dick) des Gewebes mit dem caudatus a wurden perfundierten erhaltennd Putamen wurde für 60 min bei Raumtemperatur fixiert. Für alle Verfahren enthält Fixierlösung 4% Paraformaldehyd und 4% Saccharose in PBS (frisch zubereitet oder verwendet werden innerhalb von 15 Tagen). Es ist wichtig zu beachten, dass die Fixierung Zeiten entscheidend für eine erfolgreiche Färbung sind. Overfixation können Verfärbungen durch Störung der Integrität der Plasmamembran und verursacht Farbstoff Leck aus der Zelle (siehe weitere Informationen unter Ergebnisse) beeinflussen. Für Verfahren A und B, sind Slices (200 um) von festen Gehirn oder Gewebe blockieren und Scheiben in 24-Well-Platte mit PBS gelegt geschnitten. Für Verfahren c, sind frisch akuten Hirnschnitten (200 um) mit einem Vibratom in Kaltschneiden Lösung (in mm) 110 Cholin-Cl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl geschnitten 2, 25 Glucose, 11,6 Ascorbinsäure, 3,1 Brenztraubensäure (Osmolarität = 310 mOsmols) und sofort nach der Scheiben in 24-Well-Platten gelegt und fixiert für 30 min mit Fixierlösung bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Scheiben mit PBS, 3-mal. Vor dem Schießen Scheiben, entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen und mit einem Pinsel, legen Sie die Scheibe in der Mitte des Brunnens. Schießen DiI Kugeln durch 3,0 um Filterpapier mit einer Helios Gene Gun-System bei 120-180 psi Heliumgasdruck, indem Sie die Pistole in einem Abstand von 1,5 cm zwischen der Probe und dem Ende des Laufes. (Wichtiger Hinweis:. Nur Neuronen innerhalb von 50 mm von der Scheibe Oberfläche wird durch diese Methode gekennzeichnet werden, so ist es wichtig, auf der gleichen Seite der Scheibe nach oben in den Waschungen und für die Montage zu halten Auf diese Weise werden Sie sicherstellen, dass die markierten Neuronen innerhalb Brennweite bei Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop). Wash Scheiben mit PBS 3 mal und speichern sie in PBS für mehrere Stunden, damit die DiI entlang der Dendriten zu verbreiten. Berg Scheiben auf einen Objektträger mit ProLong Gold-Antifade und decken mit einer 18×18 mm No.1 Deckglas. (Hinweis: für das Verfahren c, ist es am besten Scheiben noch am selben Tag Netzlaufwerk, da die Integrität der Scheiben ist nicht gut gepflegt über Nacht). Seal mit klarem Nagellack nach der Montage Medien getrocknet ist. Alternativ können die Scheiben mit Antikörpern vor der Montage wie unten beschrieben gefärbt werden. (Hinweis: Folien können verwendet werden mindestens 6 Monate bis ein Jahr, wenn im Dunkeln gelagert bei 4 ° C DiI ist lichtempfindlich und langfristige Einwirkung von Licht werden die Flecken verursachen zu verblassen). 4. Antikörper-Färbung: Immunfärbung sollte nach dem Schritt 3,4 und vor der Montage durchgeführt werden. Permeabilisierung: Inkubieren Scheiben in 0,01% Triton X-100 in PBS-Lösung für 15 min bei Raumtemperatur (300-500 ul pro Well). HINWEIS: Verwenden Sie keine höheren Konzentrationen von Waschmittel, da dies DiI auflösen wird und deutlich reduzieren Fluoreszenzfärbung. Versuchen Sie, die Zeit in Reinigungsmittel zu minimieren so umfangreich Inkubationen reduzieren auch die DiI Markierung. Wenn erweiterte Inkubationen notwendig sind, halten Scheiben in PBS statt in Blocking-Lösung. Blocking: Inkubieren Scheiben in Blocking-Lösung mit 10% Ziegenserum, 0,01% Triton X-100 in PBS für 30 min bei Raumtemperatur. Primärer Antikörper: Add-Antikörper bei der gewünschten Verdünnung in Blockierungslösung (z. B. Kaninchen anti-GFP Antikörper bei 1:1000 Verdünnung). Add 300-500 ul pro Well und Inkubation für 1-2 Stunden. (Hinweis: Wenn über Nacht Inkubationen notwendig sind, zu entfernen Waschmittel Blockierungslösung). Wash Scheiben mit PBS für 5 bis 15 min, 3-mal. Sekundäre Antikörper: Inkubieren mit sekundärem Antikörper für 30 min bei Raumtemperatur. Bereiten sekundären Antikörper-Lösung in der gewünschten Verdünnung in Blockierungslösung (zB Alexa-Fluor 488 konjugierten Antikörper bei 1:1000 Verdünnung). Wash Scheiben mit PBS für 5-15 min, 4-mal. Berg Scheiben auf Folien mit ProLong Gold-Antifade und decken mit einer 18×18 mm No.1 Deckglas. Seal mit Nagellack nach der Montage Medien getrocknet ist. 5. Repräsentative Ergebnisse: Überprüfung auf korrekte Kennzeichnung: Section kann unter einem Fluoreszenz-Binokular mit einer Quecksilberlampe und rot fluoreszierende Filterwürfel erfolgreiche DiOLISTIC Kennzeichnung bestätigen ausgestattet visualisiert. Abbildung 1 zeigt beispielhaft Bilder schön beschriftet Hirnschnitten bei geringer Vergrößerung erhalten. Zwei wichtige Eigenschaften zu suchen sind eine spärliche Beschriftung Muster (Abbildung 1A) und die Möglichkeit, einzelne Zellbestandteile (Abbildung 1B-C) zu identifizieren. </li> Troubleshooting DiOLISTIC Etikettierung: Abbildung 2 zeigt Beispiele für Abschnitte, in denen die DiOLISTIC Kennzeichnung funktionierte nicht richtig. Nach unserer Erfahrung gibt es drei Hauptursachen für ineffiziente Etikettierung: Labeling ist zu dünn oder dicht: Sehr wenige Zellen pro Abschnitt in einem Fall beschriftet oder zu viele Zellen markiert sind verhindert die Isolierung und Untersuchung einzelner Zellelemente. Lösung: Passen Sie die Konzentration der Kügelchen in die endgültige Lösung für die Beschichtung der Kugel TEFZEL Schlauch (Abschnitt 1.6) verwendet. Abnahme oder Zunahme des Volumens von Wasser (3 ml Anfangswert) verwendet werden, um die Perlen zu lösen, um für zu dünn oder zu dicht Kennzeichnung korrekt ist, bzw.. Darüber hinaus könnten geringe Effizienz der Kennzeichnung durch eine nicht optimale Gasdruck verursacht werden bei der Aufnahme der beschichteten Perlen auf den Abschnitten. Diese Möglichkeit kann, indem sichergestellt wird, dass die TEFZEL Kugel Schlauch hat die meisten der Kügelchen freigesetzt und es scheint, nach der Aufnahme klar ausgeschlossen werden. Ansonsten sollte Gasdruck für die Aufnahme erhöht werden. Bad Kugeln: große Klumpen oder Haufen von Farbstoff beschichtete Wolfram Perlen sind während der Vorbereitung Kugel gebildet. Abschnitte werden Beispiele in Abbildung 2A-B ähneln. Lösung: Stellen Sie neue Kugeln mit besonderem Augenmerk auf Abschnitt 1.5 und / oder zu erweitern Beschallungszeit in Abschnitt 1.6. Over-Fixierung: Gewebe wird in Paraformaldehyd-Lösung für mehr als die optimal benötigte Zeit für die Befestigung (30 Minuten für 200-300 um Abschnitte, 1 Stunde für 4 mm Abschnitte) gehalten. Dies gefährdet die Integrität der Plasmamembran und produziert markierte Abschnitte, wie in Abbildung 2C-D gezeigt, in der Kennzeichnung scheint out of focus aufgrund der Dispersion des Farbstoffes aus den Zellen heraus zu suchen. Lösung: Reduzierung Fixierung Zeit. Konfokale Bildgebung: Image Stacks sind aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM 510 META) mit einem 20x-Objektiv für die ganze Zelle und 63x Wasserimmersionsobjektiv für Dendriten Segmenten. DiI war begeistert mit einem DPS 561 nm Laserlinie und grüne Fluoreszenz des sekundären Antikörpers war begeistert mit einem 488 nm Laser-Linie. Die optische Schnitte der markierten Probe erreicht werden, wenn die konfokale Mikroskopie ermöglicht ferner zur Isolierung von einzelnen markierten Zellen in der Probe. Abbildung 3A zeigt einen striatalen Medium stacheligen Neuron aus Maus Gehirns und seiner komplexen Dendriten Zweig Muster. Hohe Vergrößerung Bilder von Dendriten Zweige dieser Neuronen aus Nagetieren (3B) und nicht-menschliche Primaten (Abbildung 3C) zeigen den Grad der Färbung in Dendriten und dendritischen Dornen mit dieser Technik in beiden Spezies. Dendriten und deren Vorsprünge (Stacheln) scheinen gut definiert, auch wenn man die langen, dünnen Wirbelsäule Köpfe so reichlich in mittlerer stachelige Neuronen. Bei der Kombination von DiOLISTICS mit Immunfärbung ist konfokale Bildgebung auch in eindeutig lokalisiert den Fleck auf der gleichen Bildebene und derselben Zelle hilfreich. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für Kolokalisation von DiI Kennzeichnung und Immunfärbung für GFP in einer einzigen Zelle. Das Bild ist ein Stack (0,7 um z-Bereich) aus einer striatalen Slice aus einer transgenen Maus Ausdruck des fluoreszierenden Proteins GFP unter der D1 Dopamin-Rezeptor-Promotors. Abbildung 1. DiI Markierung von Neuronen in Hirnschnitten von nicht-menschlichen Primaten. (A) geringer Vergrößerung Bild eines gefärbten Hirnschnitten mit dem Nucleus caudatus von einem Cynomolgusaffen dass spärliche Beschriftung von Neuronen mit DiI zeigt. (BC) Isolated Medium stachelige Neuronen können leicht identifiziert werden mit einem fluoreszierenden Binokular. Abbildung 2. Fehlerbehebung DiOLISTIC Kennzeichnung. (AB) Stained Scheiben von dorsale Striatum der Affen (A) und Maus (B) zeigt große Klumpen von Farbstoff-beschichteten Beads und als Folge davon, keine einzelnen zellulären Elementen unterschieden werden können. (CD) Bilder, die das Ergebnis der Anwendung DiOLISTIC beispielhaft Kennzeichnung auf Abschnitte, die in Fixierlösung für längere Zeit oder bei denen Gewebe Erhaltung aufbewahrt wurden nicht in Affen (C) und Maus (D) Gewebe. Abbildung 3. Konfokale Bild der striatalen Medium stacheligen Neuron mit DiI gefärbt. (A), ermöglicht Bildstapel einer ganzen Zelle für die morphologische Analyse der dendritischen Verzweigungen. (BC) Dendrite Segmente aus der Maus (B) und Affen (C) mittlere stachelige Neuronen zeigen eine klare Kennzeichnung von Dendriten und Dornen. Abbildung 4. Die Kombination DiOLISTIC Markierung mit Immunfärbung. (A) DiI markierten <sTrong> Medium stacheligen Neuron aus Striatum von BAC transgene Maus, die GFP unter der D1 Dopamin-Rezeptor-Promotor. (B) Immunfärbung mit anti-GFP Antikörper als Methoden von Lee et al angepasst beschrieben. (2006). Gleichen Feld wie A. (C) Composite Bild rote und grüne Fluoreszenz identifiziert DiI-markierten Neuronen als GFP-positive Neuronen.