DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات
Summary
نحن لشرح استخدام المسدس لإدخال جينات الأصباغ الفلورية ، مثل الجاذبة ، في الخلايا العصبية في الدماغ شرائح من القوارض والرئيسات غير البشرية من مختلف الأعمار. في هذه الحالة بالذات ، ونحن نستخدم فئران بالغة (3-6 أشهر من العمر) والقرود cynomologus الكبار (9-15 سنة). هذه التقنية ، ووصف في الأصل من قبل المختبر ليختمن الدكتور (غان<em> وآخرون</em> ، 2000) ، هي مناسبة تماما لدراسة الشجيرية المتفرعة ومورفولوجيا شجيري العمود الفقري ويمكن دمجها مع immunostaining التقليدية ، إذا كان يتم الاحتفاظ المنظفات بتركيز منخفض.
Abstract
تلطيخ DiOLISTIC يستخدم المسدس لإدخال جينات الأصباغ الفلورية ، مثل الجاذبة ، في الخلايا العصبية في الدماغ من شرائح (غان وآخرون ، 2009 ؛. اوبراين وLummis ، 2007 ؛ غان وآخرون ، 2000). هنا نقدم وصفا تفصيليا لكل خطوة من الخطوات المطلوبة مع صور مثالية من النتائج الجيدة والسيئة التي من شأنها أن تساعد عند إعداد هذه التقنية. في تجربتنا ، ثبت بضع خطوات حاسمة من أجل التطبيق الناجح للDiOLISTICS. هذه الاعتبارات تشمل نوعية الرصاص الجاذبة المغلفة ، ومدى التعرض تثبيتي ، وتركيز المنظفات المستخدمة في حلول الحضانة. وتقدم النصائح والحلول للمشاكل المشتركة.
هذا هو أسلوب وضع العلامات متعددة الجوانب التي يمكن تطبيقها على الأنواع الحيوانية متعددة في مجموعة واسعة من الأعمار. خلافا لغيرها من تقنيات الوسم الفلورسنت التي تقتصر على الأعمال التحضيرية من الحيوانات الصغيرة أو تقتصر على الفئران لأنها تعتمد على التعبير عن التحوير فلوري ، يمكن تطبيق وضع العلامات DiOLISTIC للحيوانات من جميع الأعمار والأنواع والأنماط الجينية ويمكن استخدامه في تركيبة مع immunostaining لتحديد subpopulation محددة من الخلايا. نحن هنا لشرح استخدام DiOLISTICS إلى الخلايا العصبية في الدماغ التسمية في شرائح من الفئران البالغين والكبار الرئيسات غير البشرية وذلك بهدف قياس تغصن متفرعة ومورفولوجيا شجيري العمود الفقري.
Protocol
Discussion
وسم DiOLISTIC هي واحدة من أكثر التقنيات المتاحة للخلايا متعددة العلامات fluorescently لأنه لا يمكن تطبيقه على أنسجة من المقاطع الأنواع المختلفة ، على مجموعة واسعة من الأعمار ، والأنسجة التي تم الحصول عليها طازجة أو من تثبيتي – perfused الحيوانات (انظر أيضا غان وآخرون . ، 2009). عملية سريعة نسبيا لأنه يأخذ 1-2 أيام ، ويمكن دمجها مع غيرها من الأساليب الكلاسيكية أكثر العلامات مثل immunostaining (لي وآخرون ، 2006). وينبغي إيلاء اهتمام خاص لتجنب حول تحديد واستخدام تركيزات عالية المنظفات في الحضانة ، لأن هذه الحلول سيضم سلامة غشاء محبة للدهون وتؤدي إلى تسرب الصبغة خارج الخلايا. ويمكن تسهيل اختراق الأجسام المضادة التي تركيزات منخفضة من تريتون X – 100 (لي وآخرون ، 2006) ، فضلا عن ديجيتونين أو سابونين في حل الحضانة (Matsubayashi وآخرون ، 2008). بعض التعديلات التي يمكن تطبيقها على هذه التقنية بما في ذلك استخدام الرصاص مع الأصباغ متعددة كما وصفها آخرون غان (2000) أو تغيير طول ونوع من التعرض للأجسام المضادة (نيلي وآخرون ، 2009).
تقليديا ، استخدمت الجاذبة لتتبع توقعات العصبية في الدماغ. وسم DiOLISTIC توسع تطبيقها من خلال وصف وسيلة مفيدة لدراسة مورفولوجية الخلية. مورفولوجيا الخلايا العصبية هي ذات أهمية كبيرة وذلك بسبب التنوع الكبير الموجود في الدماغ وتكهنات بأن شكل الخلية قد تنعكس على وظيفة تعدد السكان الخلايا العصبية في الجهاز العصبي. أحد الأمثلة على ذلك هو حقيقة أن الخلايا العصبية الكثيرة في الجهاز العصبي لدى الثدييات عرض نتوء صغير يسمى العمود الفقري شجيري التي هي من نقاط الاشتباك العصبي موقع glutamatergic. بهذه الطريقة ، يمكن أن ترتبط كثافة نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic على خلية لكثافة الأشواك الجذعية ، والتي يمكن قياسها باستخدام تقنية وضع العلامات الموضحة في هذه الوثيقة. وعلاوة على ذلك ، يمكن كميا المعلمات المورفولوجية الأخرى مثل إجمالي طول تغصن ، ونمط المتفرعة ، شجيري العمود الفقري شكل وكثافة ودراستها.
استخدام العلامات الفلورية لدراسة مورفولوجية العصبية العديد من المزايا بالمقارنة مع التقنيات التقليدية التي تعتمد على الحقل المجهري مشرق (مثل تلطيخ غولجي) لأنه يسمح للتصوير مبائر دقة أعلى. ميزة أخرى لاستخدام الجاذبة بوصفها fluorophore في التجارب التي تهدف إلى قياس كثافة العمود الفقري شجيري ومورفولوجيا وخصائصه محبة للدهون. أقسام الجاذبة في غشاء البلازما ويقدم الخطوط العريضة واضحة المعالم من العمليات العصبية ونتوءات شجيري. نظرا لصغر حجم معظم العمود الفقري شجيري (أقل من 1 فيمتولتر) ، وتلطيخ غشاء هو أكثر كفاءة ويسمح لأفضل تصور نتوءات صغيرة ورقيقة من تلطيخ هيولي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف مايكل فيدر وهولواي تيريل على المساعدة التي قدموها خلال مجموعة أولية تتألف من التقنية والمختبرية الدكتور Fumi اونو ثانية للحصول على المجهر مبائر بهم. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المعهد الوطني للصحة من خلال برنامج وجماعية من NIAAA NINDS.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | ||
| Methylene chloride | Mallinckrodt Chemicals | H485-06 | ||
| Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter | |
| Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | ||
| Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | ||
| Isopore membrane filter paper | Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | ||
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOLISTIC” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
- Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes. Methods. 30, 79-85 (2003).
- Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).
- Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin. J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).
- Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry. J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).
- O’Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).
- Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats. J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).
