Overview
Questo video descrive la co-coltura 3D delle cellule tumorali del seno con monociti per studiarne l'interazione in un ambiente basato sull'estratto di matrice extracellulare (ECME). Questo metodo aiuta a studiare caratteristiche specifiche come la degradazione del collagene, il reclutamento delle cellule immunitarie e l'invasione cellulare.
Protocol
1.3D co-culture con interazione diretta
- Etichettare le cellule BrC e i monociti con diversi coloranti fluorescenti prima della coltura cellulare per consentire lo smistamento indipendente di ogni lignaggio cellulare dopo la coltura per l'analisi dell'mRNA e dell'espressione proteica. Utilizzare derivati commercialmente disponibili di cumarina e rodamina che passano liberamente attraverso la membrana cellulare delle cellule viventi. Un protocollo generale per l'etichettatura è il seguente:
- Preparare un monostrato di cellule BrC di interesse (2 × 106 celle in un pallone dacoltura da 25 cm 2) e sostituire il mezzo standard con una soluzione di lavoro pre-riscaldata sufficiente del colorante fluorescente (1:2.000 del colorante fluorescente nel mezzo di base standard senza alcun supplemento). Incubare 30 min a 37 °C in un ambiente umidificato del 5% di CO2. Aspirare la soluzione colorante e risciacquare delicatamente con sufficiente 1x PBS. Aspirare il PBS e aggiungere il supporto standard.
- Tripinare il monostrato cellulare con 2 mL di una soluzione di 0,05% di tripina e 0,48 mM EDTA per 5-10 min a 37 °C. Aggiungere 200 μL di FBS per interrompere la tripinazione e 7 mL del mezzo corrispondente senza integratori. Riutilizzare le celle mediante pipettazione. Prendere un'aliquota di 10 μL per contare le cellule in una camera Neubauer. Continuare con il protocollo di co-coltura dopo il conteggio delle celle.
- Pellettizzare le cellule a 430 x g per 5 minuti a RT (eseguire questa prima da quando i monociti crescono in sospensione). Scartare le cellule supernatanti e delicatamente rimescolate con 3 mL di una soluzione di lavoro pre-riscaldata del colorante fluorescente (1:2.000 del colorante fluorescente in un mezzo di base standard senza integratori). Incubare per 30 min a 37 °C in un ambiente umidificato del 5% di CO2.
- Pellettare nuovamente le cellule, scartare la soluzione di lavorazione del colorante e rimorsi delicatamente con 5-7 mL di 1x PBS. Pellet ancora una volta, scartare il PBS e rimosogliere le cellule in 5-7 mL di mezzo standard. Prendere un'aliquota di 10 μL di sospensione cellulare per contare le cellule in una camera Neubauer. Continuare con il protocollo di co-coltura dopo il conteggio delle celle.
- Impostare la co-coltura come segue: stendere abbastanza ECME nella parte inferiore del pozzo per formare uno strato uniforme in ogni pozzo di un sistema di scorrimento a camera a 4 pozzi. Piastra 20 μL di una singola sospensione cellulare contenente 5 × 105 cellule BrC etichettate per pozzo.
- Dopo 15-20 minuti di incubazione a 37 °C, aggiungere una sospensione di 2,5 x 105 monociti etichettati in mezzo di dosaggio da 80 μL (integrato con il 60% di ECME).
- Lasciare solidificare l'ECME per 15-20 min a 37 °C.
- Aggiungere 1 mL di un mix 1:1 delle cellule BrC e dei mezzi di coltura dei monociti.
- Incubare le co-colture a 37 °C in un ambiente umidificato del 5% di CO2 per 24 ore, 48 ore o 5 giorni per tenere traccia dei cambiamenti in diversi punti di tempo.
- Degradare le proteine ECM per recuperare le cellule dalle colture. Aspirare e scartare il mezzo, aggiungere 0,5 mL di 1x PBS con 0,1% di tripside e 0,25% EDTA e incubare per 3 h a 37 °C. Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 mL di 1x PBS con FBS al 10% per neutralizzare la tripina e rimescolare le cellule tubazione vigorosamente per ottenere una sospensione a una cella.
- Le celle a pellet a 765 x g per 5 minuti a RT, scartano il supernatante e rimescolano le cellule in 5 mL di 1x PBS con FBS al 10%. Ripetere questo passaggio una volta.
- Sottoscrivi la sospensione cellulare allo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) con lo strumento appropriato. Assicurarsi che le popolazioni finali siano pure almeno al 95%).
- Dopo lo smistamento, lavare le cellule con 1x PBS sterile, pellet (430 x g per 5 minuti a RT) e risospendare in 1x PBS sterile. Le cellule possono essere elaborate secondo protocolli specifici per l'isolamento dell'RNA o l'analisi proteica.
- Ripeti ogni saggio tre volte, incluse le impostazioni cultura 3D di ogni singolo lignaggio cellulare come controlli.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 |