Изготовление и эксплуатация Кислород Вставка для Приверженец клеточных культур

1. Функция прибора Гипоксических устройство вставки содержит 6-столбы, которые гнездятся в стандартной 6-луночный планшет. Газ поступает в столб, через микрожидкостных сети на базе столб, и течет обратно из устройства. У основания столба формирования нижней стенке микроканальных является толщиной 100 мкм газопроницаемых PDMS мембрана, которая позволяет диффузии кислорода между газом микроканальных и питательных сред. Таким образом, устройство работает путем создания градиента концентрации, что диски концентрации средств массовой информации по отношению к кислороду нужное значение. Устройство обладает рядом преимуществ по сравнению с гипоксически камеры и других систем оксигенации ячейки: 1) сводит к минимуму пути диффузии кислорода позволяет быстрее временной контроль, 2) улучшает пространственную контроль над оксигенации, так как зависит от столба микроканальных дизайн, 3) обладает меньшую площадь лаборатории и более высокую пропускную способность увеличить эффективность экспериментальных и 4) адаптируется к общей культуре клеток инструментов (например многоямного пластины) без требования специальных знаний и оборудования. 2. Устройство изготовления Первый столп массив реплики формованные с PDMS в ранее обрабатываемых плесень Delran. Следующая газа микроканальных в нижней части каждого столба изготовлен с использованием стандартных SU-8 фотолитографии и PDMS реплики формования. Газа мембрана изготавливается по заданному прядение PDMS на кремниевой пластине для достижения требуемой толщины. В этом примере мы используем толщиной 100 мкм мембрану, которая была изготовлена ​​на спиннинг 500 оборотов в минуту в течение 10 секунд, а затем 900 оборотов в минуту в течение 30 секунд. Все компоненты соединены вместе после кислорода плазменной обработки с портативного устройства плазмы (модель BD-20, Electro-Technic продукты). 3. Устройство установки Аккуратно вставьте устройство в пластину, удостоверяясь, чтобы избежать пузырей. Рыбалка устройство во время вставки помогает изгнать из пузырьков с одной стороны. Для реальных клеточных экспериментов, этот шаг необходимо сделать внутри стерильного ламинарном боксе. Шансы на загрязнение значительно снижаются раз устройство вставляется, так что собрание может быть перенесено на инкубатора в нестерильных окружающей среды. Подключите трубку от бензобака источника входного и выходного портов устройства. Для клеточных экспериментов, культуры инкубатора должны иметь отверстия для разрешения трубы входа и трубки должны быть подключены после проведения устройства и поместив его в инкубатор. Будьте осторожны, чтобы не ставить избыточное давление на устройство, которое может привести к деформации PDMS достаточно, чтобы подавить основные клетки. Убедитесь, что регулятор точности поток закрывается до открытия регулятора майку, чтобы избежать переполнения устройства. Начать поток газа. Аккуратно откройте регулятор потока точности требуемый расход (50-100 мл / мин). Часы значение тесно в течение следующего часа и вносить коррективы по мере необходимости, так как падение давления будет меняться, пока система уравновешивает, изменение скорости потока. Чтобы избежать образования пузырьков в средствах массовой информации, снизить расход до 10-20 мл / мин после начальной длительностью 15 минут уравновешивания с выше скорости потока. После желаемого экспериментальных продолжительность остановки потока газа, удалить пластину, и процесс клетки соответствующим образом (например лизировать, пятна, граф, и т.д.). 4. Устройство проверки Калибровка Выберите количество и расположение позиций на флуоресцентные кислорода (FOXY) датчик слайдов (в зависимости от проверки требования), которые будут использоваться для измерения кислорода. Слайд содержит флуоресцентный краситель покрытие рутений, что тушится кислородом. Expose слайд прямо на 0, 10, и 21% кислорода из топливного бака и захвата изображений через 5 минут для правильного равновесия. Экспорт средняя интенсивность изображения для каждой позиции и концентрации участок оксигенации зависит от флуоресцентной интенсивности. Создание калибровочной кривой путем установки линейных кривых на 0-10% линии и 10-21% линии. Гетерогенность Создание нескольких точек охватывающих ширину канала на определенный интервал (например, раз в 1 мм). Обратите внимание, что там может быть перекрытие изображений в зависимости от расстояния. Мера концентрации кислорода на поверхности и с помощью устройства Уравновешивание Выберите три точки на FOXY слайд, в котором для измерения концентрации кислорода. Сразу же после захвата первого изображения при комнатной уровень кислорода, откройте регулятор потока точность для начала газового потока в устройстве. Захват изображений на соответствующий промежуток времени для оценки продолжительности и степени кислородного concentrЭйшен равновесия (например, каждые 10 секунд в течение 30 мин). 5. Применения Лечение ран За день до эксперимента, смочите стерилизовать PDMS вставки в бессывороточной среде снизить ингибируют образование пузырьков газа в скважине. Культура клетки до 100% слияния в 6-луночный планшет. Создать прямо царапины монослоев с P200 пипетки для имитации ран. Аспирируйте ячейки СМИ, промыть 5 мл СМИ и аспирации снова. Важно, чтобы не беспокоить монослоя клеток. Refill скважин с 4 мл бессывороточной среде уменьшить пролиферацию клеток. Место вставки в скважинах и подключить каждую лунку на соответствующую концентрацию кислорода. Место 6-луночный планшет с вкладышами на подогреваемых стадии при температуре 37 ° C. Захват промежуток времени изображения клеток в нужный интервал и общую продолжительность. T_Scratch MATLAB, в алгоритме раны измерения, могут быть использованы для анализа незаживающие площадь поверхности. 6. Представитель Результаты Устройство проверки Гипоксических устройство вставки экспонатов большое улучшений по сравнению с гипоксической камере по кислороду время уравновешивания и масштабы, требующие менее 2 минут для стабилизации до 0,5% кислорода. Устройство мембранного также размер разрыва дно было решающим фактором в определении равновесия эффективности, с большими размерами разрыва требуется больше времени для достижения стационарного значения концентрации кислорода. Устройство также позволяет большой контроль над пространственным оксигенации в одной скважины, что позволяет образованию нескольких условий, и даже генерации циклических профиля кислорода по поверхности хорошо. Заживление ран Сотовые монослоев подвергались 10% и 21% кислорода и площадь поверхности раны была проанализирована с течением времени. Царапины воздействию 21% кислорода закрыта медленный и на 10% быстрее. На рисунке 1 показано изображение царапины в течение 17 часов. Графики на рисунке 5, показывают, процент открытой площадке рану как для концентрации кислорода на протяжении всего эксперимента. Рисунок 1. Схема и диаграммы, иллюстрирующие функциям устройства. Устройство кислорода вставки изготовлен обычной фотолитографии (микрожидкостных сети), реплики литья (микрожидкостных сети и вставить леса), и определяется вращение PDMS (газ-мембрана). А) кислород устройство вложенные в 6-луночный планшет. Б) Примеры 24 и 96-луночного массивах столба. С) поперечного сечения Схема столба. Кислород поступает в устройство через вход и путешествует по микрожидкостных сети в нижней части колонны. Кислород может свободно проникают через газ мембрану PDMS в нижней части колонны и раствориться в культуре средств массовой информации. D) микроскопе изображение, показывающее различные особенности одноканальный столб сверху, с связаны стекла сообщений для уравновешивания исследований. Рисунок 2. Проверка устройства с датчиками кислорода. Напряжение кислорода в каждую лунку характеризовался использованием плоских кислорода рутений датчика. Все кислородных смесей, содержащейся сбалансированной азота и 5% CO 2 для буферизации информации. ) Земельный иллюстрирующие влияние сообщению высоте, и, таким образом диффузии кислорода расстояние между мембраной и клеток, на время равновесие и эффективность. Высоты были установлены граненые сообщения связаны с нижней части устройства. Все три раза после выхода размеры равновесия намного улучшилась за гипоксической камере. Обратите внимание, что время работает на логарифмической шкале. B) земельный изображающих быстрое кислорода уравновешивания время отклика 0,2 Устройство разрыва мм. С) многопозиционная linescans также были приняты во полным микроканальных для обеспечения однородности концентрации кислорода введен устройства. График изображает концентрации кислорода измеряли после вливания 0%, 10% и 21% кислорода в течение 10 мин. D) Устройство эффективно поддерживает 10% кислорода в течение 5 дней. Рисунок 3. Эксперименты с более сложными кислорода микроканальных конструкций. ) Dual условием микроканальных установки дает стабильный 0% и 21% кислорода профиля более 14 дней. Б) штыревой и извилистые структуры 500 мкм, шириной микроканалов расширения через йэлектронной столб приводит к циклической профиля кислорода. Обратите внимание, что данные только изображает одного представителя суда, как микроканальных выравнивание было трудно. Рисунок 4. Timelapse образы закрытия раны 0, 7 и 17 часов после начального нуля. Клетки были доставлены 21% кислорода по всему продолжительность эксперимента. Рисунок 5. Влияние концентрации кислорода на скорость заживления ран в царапинам анализа.