Incapsulamento PuraMatrix delle cellule tumorali

Note tecniche: Gelificazione è iniziata con l'aggiunta di sali. Pertanto, è fondamentale che i sali non vengono a contatto con PuraMatrix fino a gelificazione è desiderato, l'esposizione a sali di molto bassa forza ionica (ad esempio, <0,05 M) causerà gelificazione irreversibile. Soluzioni rimanenze che vengono preparati possono essere usati in un secondo momento a condizione che non sono venuto in contatto con i sali. Non è necessario preoccuparsi di sonicazione ripetere. Le bolle d'aria può essere rimosso aliquoting PuraMatrix in provette sterili seguita da centrifugazione. Prestate molta attenzione durante i cambi di mezzi di comunicazione come l'aspirazione può facilmente interrompere il letto PuraMatrix. Materiali: BD PuraMatrix Peptide RAD16 Hydrogel-1% (Cat # 354250): la concentrazione del peptide totale della miscela non diluito è di 10 mg / ml. Acqua Sonicator Vasca o Vortex 96-bene delle cellule piatto cultura Colture Cellulari media Sterile filtrata H 2 O Saccarosio sterile filtrata 20% Cellule (il tutto a 5.000 cellule / pozzetto): OVCAR-5 Tutte le fasi devono essere eseguite in condizioni asettiche. Procedimento: Sonicare PuraMatrix l'1% (RAD16) in un sonicatore acqua del bagno per 30 minuti per ridurre la viscosità prima dell'uso. La soluzione PuraMatrix 1% può essere aliquotati in provette sterili per semplificare futuri esperimenti. Evitare la formazione di bolle d'aria, se si tratta di semplicemente rallenta il provette sterili contenenti PuraMatrix a 1000 rpm (300 xg) per 5 minuti. La concentrazione del peptide totale della miscela non diluito è di 10 mg / ml. Due set di 4 pozzi saranno placcato a 2,5 mg / ml e 1,25 mg / ml di concentrazione del peptide totale, rispettivamente. Diluire il PuraMatrix in ciascun pozzetto insieme con 0,2 micron sterile filtrata saccarosio 20% e il 13,3% di saccarosio al totale delle concentrazioni del peptide di 5 mg / ml e 2,5 mg / ml, rispettivamente, per ottenere una concentrazione di 2x BD PuraMatrix nel 10% di saccarosio. Fare il 20% di saccarosio, diluire 10 g di saccarosio, poi volume di 50 ml di acqua. 13% e il 10% di saccarosio può essere preparato diluendo la soluzione madre al 20%. 13% di saccarosio (per ogni ml 10): 6,5 ml di saccarosio al 20% + 3,5 ml sterili H 2 O. 10% di saccarosio (per ogni ml 10): 5,0 ml di saccarosio al 20% + 5.0 ml sterile H 2 O. Preparare una master mix di peptidi PuraMatrix in base al numero di pozzi che si intende piatto. (Vedi esempio sotto). Poi aliquota in singoli tubi contenenti 25 ml della master mix. Il master mix dovrebbe essere preparato a due volte la concentrazione finale desiderata di peptide totale in quanto sarà diluito con un uguale volume di cellule durante la placcatura. Preparare sospensioni cellulari da trypsinizing cellula colture cellulari monostrato. 2 ml di 0,05% tripsina EDTA può essere utilizzato per ogni T-75 Flask. Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta dei terreni di coltura cellulare contenente il 10% inattivato con il calore di siero fetale bovino (uso almeno 2 ml di mezzi per ml di tripsina utilizzato nel passaggio precedente). Centrifugare le cellule a 1000 giri (~ 300 xg) per 5 minuti per creare un pellet di cellule. Risospendere le cellule nel 10% di saccarosio sterile filtrata. Contare le celle e girare di nuovo a 1000 giri (~ 300 xg) per 5 minuti per rimuovere tracce di sale trovato nei media. Risospendere il OVCAR-5 cellule in 10% di saccarosio a 2,0 x 10 5 cellule / ml, in modo che il conteggio finale delle cellule per pozzetto saranno 5.000 cellule in ciascun pozzetto. Le seguenti operazioni devono essere eseguite rapidamente. Aggiungere 25 microlitri di 2.0 x 10 5 cellule / ml di sospensione per il primo tubo singolo contenente 25 microlitri della master mix di PuraMatrix come indicato nello schema di cui sopra. Mescolare rapidamente pipettando (~ 5 volte su e giù) nel tubo senza introdurre bolle d'aria. Pipettare quindi i 50 microlitri di cellule sospensione / PuraMatrix miscela nel pozzo appropriato di un piatto ben 96. Avviare gelificazione del PuraMatrix BD pipettando gentilmente 150 microlitri terreni di coltura cellulare (RPMI + 10% FBS) al lato del bene Ripetere la procedura descritta in 8 fino a quando tutti i pozzetti sono stati placcati. Dopo 30 minuti molto delicatamente rimuovere ~ 2 / 3 della media con una pipetta 200 microlitri per equilibrare il pH del idrogel. NON UTILIZZARE UN VUOTO IN QUESTO ASPIRATORE ostacolerà la MATRIX Posizionare la punta della pipetta nel pozzetto in modo chenon toccare il letto PuraMatrix e delicatamente rimuovere il supporto dal pozzo. Si deve prestare attenzione a non disturbare la matrice durante la coltura di cellule in PuraMatrix. Molto delicatamente aggiungere 150 ml di mezzi freschi colture cellulari al lato del pozzetto contenente cellule incapsulate in PuraMatrix. Cambiare il terreni di coltura di cellule in ciascun pozzetto ogni 48 ore con terreni di coltura fresco con attenzione ripetendo i punti 10 e 11. Rappresentante dei risultati: Figura 1. OVCAR-5 cellule sono state incapsulate, come descritto nel protocollo di cui sopra. Immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio rovesciato Olympus FV1000 dotato di Spectra-Physics DeepSee Ti: zaffiro laser sintonizzati a 750 nm. Sessioni di imaging sono state condotte nei giorni 1, 3, 5 e 7 post-placcatura. A distanza di lavoro, l'acqua immergendo obiettivo 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) è stato utilizzato per l'immagine attraverso la PuraMatrix. Volumi tridimensionali sono stati raccolti attraverso l'acquisizione di immagini in stack 1,47 micron passi assiale. Due non-descanned rivelatori di raccolti tramite l'emissione di autofluorescenza violetto (440-490 nm) e verde (510-550 nm) Filtri a banda passante. Le immagini finali e filmati stack di profondità sono stati elaborati utilizzando ImageJ unendo entrambi i canali di rilevazione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.