PuraMatrix Encapsulation של תאים סרטניים

טכנית הערות: Gelation הוא שיזם תוספת של מלחים. לכן, זה קריטי, כי מלחי לא לבוא במגע עם PuraMatrix עד gelation היא הרצויה; חשיפה מלחי כוח יוניים נמוך מאוד (למשל, <0.05 מ ') תגרום gelation בלתי הפיך. פתרונות שאריות מלאי כי הם מוכנים ניתן להשתמש במועד מאוחר יותר, בתנאי שהם לא באים במגע עם מלחים. אתה לא צריך לדאוג sonication לחזור. בועות האוויר ניתן להסיר aliquoting PuraMatrix לתוך צינורות סטרילי ואחריו צנטריפוגה. היזהר מאוד בזמן שינויים מדיה כשאיפה יכול בקלות לשבש את המיטה PuraMatrix. חומרים: BD PuraMatrix פפטיד RAD16 Hydrogel-1% (Cat # 354250): ריכוז הפפטיד הכולל של התערובת חי היא 10 מ"ג / מ"ל. אמבט מים Sonicator או וורטקס 96, גם בתא תרבות צלחת תרבית תאים מדיה סינון סטרילי H 2 O סטרילי סוכרוז 20% מסוננים תאים (כל התאים ב 5000 / טוב): OVCAR-5 כל הצעדים חייבים להתבצע בתנאים aseptic. נוהל: Sonicate PuraMatrix 1% (RAD16) ב sonicator מים באמבטיה במשך 30 דקות כדי להפחית את צמיגות לפני השימוש. הפתרון PuraMatrix 1% כעת ניתן aliquoted לתוך צינורות סטרילי כדי לפשט ניסויים עתידיים. הימנע היווצרות של בועות אוויר, אם הם יוצרים פשוט ספין את צינורות סטרילי המכיל PuraMatrix ב 1000 סל"ד (300 XG) במשך 5 דקות. ריכוז הפפטיד הכולל של התערובת חי היא 10 מ"ג / מ"ל. שני סטים של 4 בארות יהיה מצופה ב 2.5 מ"ג / מ"ל ​​ו – 1.25 מ"ג / מ"ל ​​פפטיד ריכוז מוחלט, בהתאמה. לדלל את PuraMatrix בכל להגדיר היטב עם 0.2 מיקרומטר סטרילי סוכרוז 20% מסונן סוכרוז 13.3% לריכוזים פפטיד סך של 5 מ"ג / מ"ל ​​ו – 2.5 מ"ג / מ"ל, בהתאמה כדי להשיג ריכוז של 2x BD PuraMatrix ב סוכרוז 10%. To Make סוכרוז 20%, לדלל 10 גרם של סוכרוז, אז נפח 50 מ"ל מים. 13% סוכרוז ו 10% יכול להיות מוכן על ידי דילול פתרון המניה 20%. סוכרוז 13% (עבור כל 10 מ"ל): 6.5 מ"ל סוכרוז 20% + 3.5 מ"ל סטרילי H 2 O. 10% סוכרוז (עבור כל 10 מ"ל): 5.0 מ"ל סוכרוז 20% + 5.0 מ"ל סטרילי H 2 O. הכינו תערובת אמן PuraMatrix הפפטיד מבוסס על מספר בארות אתה מתכוון צלחת. (ראו דוגמה להלן). Aliquot ואז לתוך צינורות בודדים המכיל 25 מ"ל של תערובת האב. לערבב האב צריך להיות מוכן בריכוז פעמיים הסופית הרצויה של הפפטיד הכולל כפי שהוא יהיה מדולל עם נפח שווה של תאים במהלך ציפוי. הכן השעיות התא על ידי trypsinizing monolayer תא בתרביות תאים. 2 מ"ל של 0.05% טריפסין EDTA יכול לשמש Flask T-75 כל אחד. לנטרל את טריפסין על ידי תוספת של תרבות התקשורת התא המכיל 10% נסיוב מומת חום שור העובר (להשתמש לפחות 2 מ"ל של התקשורת לכל מ"ל של טריפסין משמש בשלב הקודם). צנטריפוגה התאים ב 1000 סל"ד (~ 300 XG) במשך 5 דקות כדי ליצור תא גלולה. Resuspend התאים סוכרוז 10% סינון סטרילי. ספירת התאים ספין שוב ב 1000 סל"ד (~ 300 XG) במשך 5 דקות להסיר כמויות זעירות של מלח נמצא בתקשורת. Resuspend OVCAR-5 תאים סוכרוז 10% ב 2.0 x 10 5 תאים / מ"ל כך לספור התא הסופי לכל טוב יהיה טוב 5000 תאים כל אחד. השלבים הבאים יש לבצע במהירות. הוסף 25 μl של 10 x 2.0 5 תאים / מ"ל השעיה אל הצינור היחיד first המכיל 25 μl של תמהיל אמן PuraMatrix כפי שמוצג סכמטית לעיל. לערבב במהירות על ידי pipetting (~ 5 פעמים הלוך ושוב) בצינור ללא החדרת בועות אוויר. ואז פיפטה 50 תערובת μl השעיה / PuraMatrix התא לתוך הבאר המתאים מנה 96 באר. ליזום gelation של PuraMatrix BD ידי בעדינות pipetting 150 μl תרבית תאים מדיה (RPMI + 10% FBS) לצד הבאר חזור על הפעולות המתוארות 8 עד שכל בארות כבר מצופה. לאחר 30 דקות להסיר בעדינות רבה ~ 2 / 3 של התקשורת באמצעות פיפטה 200 μl לאזן את רמת החומציות של הידרוג. אל תשתמש ASPIRATOR אבק כמו זה ישבש את MATRIX הניחו את קצה פיפטה את הבאר כךזה לא נוגע במיטה PuraMatrix בעדינות להסיר מדיה מן הבאר. יש להקפיד לא לשבש את מטריקס במהלך התרבות התאים PuraMatrix. בעדינות להוסיף 150 μl של התקשורת בתרבות טרי תא לצד התאים המכילים גם הגלום PuraMatrix. שינוי התרבות תאים התקשורת בכל טוב כל 48 שעות עם התקשורת בתרבות טרי בקפידה על ידי חזרה על שלבים 10 ו -11. נציג תוצאות: באיור 1. OVCAR-5 תאים היו ארוזים כמתואר בפרוטוקול לעיל. תמונות נרכשו באמצעות הפוכה אולימפוס FV1000 מיקרוסקופ המצויד Spectra-Physics DeepSee טי: ספיר לייזר מכוון 750 ננומטר. הפעלות הדמיה שנערכו בימים 1, 3, 5 ו – 7 שלאחר ציפוי. מרחק עבודה ארוך, טובלים במים אובייקטיבי 40X (אולימפוס LUMPLFLN 0.8 NA) שימש תמונה דרך PuraMatrix. תלת ממדי כרכים נאספו באמצעות רכישת ערימות התמונה צעדים 1.47 מיקרומטר צירית. שני אי – descanned גלאי אסף את פליטת autofluorescence באמצעות סגול (440-490 ננומטר) וירוק (510-550 ננומטר) מסננים bandpass. התמונות הסופית וסרטים מחסנית עומק עובדו באמצעות ImageJ על ידי שילוב שני ערוצי גילוי. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.