L'encapsulation des cellules cancéreuses PuraMatrix

Notes techniques: La gélification est initiée par l'ajout de sels. Par conséquent, il est essentiel que les sels ne viennent en contact avec PuraMatrix jusqu'à gélification est désiré, l'exposition aux sels de la force ionique très faible (par exemple, <0,05 M) provoque la gélification irréversible. Les restes de solutions de stock qui sont prêts peuvent être utilisés à une date ultérieure à condition qu'ils ne l'ont pas entrer en contact avec des sels. Vous n'avez pas besoin de s'inquiéter sonication répéter. Les bulles d'air peuvent être enlevés aliquotage PuraMatrix dans des tubes stériles suivis par centrifugation. Soyez très prudent lors des changements de médias comme l'aspiration peut facilement perturber le lit PuraMatrix. Matériaux: BD PuraMatrix RAD16 Peptide-1 Hydrogel% (Cat # 354250): La concentration de peptide total du mélange non dilué est de 10 mg / ml. Sonicator bain-marie ou Vortex 96 puits, boîte de culture cellulaire Milieux de culture cellulaire Filtré stérile H 2 O Stérile Saccharose filtrée à 20% Cellules (tous à 5000 cellules / puits): OVCAR-5 Toutes les étapes doivent être effectuées dans des conditions aseptiques. Procédure: Soniquer l'PuraMatrix 1% (RAD16) dans un sonicateur bain-marie pendant 30 minutes pour réduire la viscosité avant de l'utiliser. La solution PuraMatrix 1% peuvent désormais être répartie dans des tubes stériles pour simplifier de futures expériences. Eviter la formation de bulles d'air, si elles forment tout simplement spin bas des tubes stériles contenant PuraMatrix à 1000 rpm (300 xg) pendant 5 minutes. La concentration de peptide total du mélange non dilué est de 10 mg / ml. Deux séries de quatre puits seront plaquées à 2,5 mg / ml et 1,25 mg / ml de concentration de peptide total, respectivement. Diluer le PuraMatrix dans chaque puits mis à 0,2 um stériles sucrose filtrée à 20% de saccharose et de 13,3% au total des concentrations de peptide de 5 mg / ml et 2,5 mg / ml, respectivement pour atteindre une concentration de BD 2x PuraMatrix de 10% de saccharose. Faire 20% de saccharose, diluer 10 g de saccharose, puis le volume à 50 ml d'eau. 13% et 10% de saccharose peut être préparé en diluant la solution stock de 20%. 13% de saccharose (pour chaque 10 ml): 6,5 ml de saccharose à 20% + 3,5 ml stériles H 2 O. 10% de saccharose (pour chaque 10 ml): 5,0 ml de saccharose à 20% + 5,0 ml stériles H 2 O. Préparer un mélange maître de peptide PuraMatrix basé sur le nombre de puits que vous l'intention de la plaque. (Voir l'exemple ci-dessous.) Puis aliquotes dans des tubes individuels contenant 25 ml de mélange maître. Le master mix doit être préparé à deux fois la concentration finale souhaitée du peptide totale car il sera dilué avec un volume égal de cellules pendant le placage. Préparer les suspensions de cellules par trypsinisation cultures cellulaires monocouche cellulaire. 2 ml de Trypsine EDTA 0,05% peut être utilisé pour chaque flacon T-75. Neutraliser la trypsine par addition de milieux de culture cellulaire contenant 10% inactivé par la chaleur du sérum de veau fœtal (utiliser au moins 2 ml de milieu par ml de trypsine utilisée dans l'étape précédente.) Centrifuger les cellules à 1000 rpm (~ 300 xg) pendant 5 minutes pour créer un culot cellulaire. Resuspendre les cellules dans 10% de saccharose filtrée stérile. Compter les cellules et les spin-down à nouveau à 1000 rpm (~ 300 xg) pendant 5 minutes pour éliminer des traces de sel dans les médias. Resuspendre les cellules OVCAR-5 dans 10% de saccharose à 2,0 x 10 5 cellules / ml sorte que le nombre final de cellules par puits sera 5000 cellules dans chaque puits. Les étapes suivantes doivent être effectuées rapidement. Ajouter 25 ul de l'2,0 x 10 5 cellules / ml, suspension pour le premier tube individuels contenant 25 ul du mélange maître de PuraMatrix comme le montre le schéma ci-dessus. Mélanger rapidement à la pipette (~ 5 fois haut et bas) dans le tube, sans introduire de bulles d'air. Puis la pipette de la cellule de 50 ul de suspension / PuraMatrix mélange dans le puits approprié d'un plat de 96 puits. Initier la gélification de la BD par PuraMatrix délicatement pipetage 150 ul milieux de culture cellulaire (RPMI + 10% de FBS) sur le côté du puits Répétez les étapes décrites dans 8 jusqu'à ce que tous les puits ont été plaqués. Après 30 minutes très doucement supprimer ~ 2 / 3 de la presse à l'aide d'une pipette 200 pi pour équilibrer le pH de l'hydrogel. NE PAS UTILISER un aspirateur AS Cela perturbera LA MATRICE </strong> Placez la pointe de la pipette dans le puits afin qu'il ne touche pas le lit PuraMatrix et retirez délicatement les médias à partir du puits. Des précautions doivent être prises pour ne pas perturber la matrice lors de la culture de cellules dans PuraMatrix. Très doucement, ajouter 150 l de frais milieux de culture cellulaire sur le côté des cellules contenant ainsi encapsulé dans PuraMatrix. Changer le milieu de culture cellulaire dans chaque puits toutes les 48 heures avec milieu de culture frais en prenant soin de répéter les étapes 10 et 11. Les résultats représentatifs: Figure 1. OVCAR-5 cellules ont été encapsulé comme décrit dans le protocole ci-dessus. Les images ont été acquises en utilisant une inversé Olympus FV1000 microscope équipé de Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire laser réglé à 750 nm. Séances d'imagerie ont été menées sur les jours 1, 3, 5 et 7 de post-plaquage. Une longue distance de travail, de l'eau plongeant objectif 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) a été utilisé pour l'image à travers le PuraMatrix. Tridimensionnelle des volumes ont été recueillies par l'acquisition de piles d'images dans les étapes 1,47 um axiale. Deux organisations non descanned détecteurs recueillies à l'aide de l'émission l'autofluorescence violet (440-490 nm) et vert (510-550 nm) filtres passe-bande. Les images finales et les films pile de profondeur ont été traitées à l'aide ImageJ en combinant deux canaux de détection.