Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

<p class="jove_title"> 1. MEFS, Viral İletimi</p><ol><li> Deney, mont, GKD filtre jelatin steril% 0.2 ile 15 cm hücre kültürü çanak başlamadan önce gün₂ O. 37 geceleme plaka inkübe ° C ve% 5 CO₂.</li><li> Jelatin kaplı çanak ve tohum MEF hücrelerinin (Nanog-GFP/rtTA MEF hücreleri kullanılır) 4×10 yoğunluğu sıvı aspire⁵ Çanak başına hücre. MEF besi 30 ml (450ml DMEM ile desteklenmiş 50 ml FBS, 5 ml 100x non-esansiyel amino asit, 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml 200 mM L-glutamin ve 0.5 ml 55mm β-mercaptoethanol) hücrelerin inkübe 37 ° C ve% 5 CO az iki gün₂ Konfluent yaklaşık% 80 kadar.</li><li> Orta aspire ve 30 ml konsantre lentivirüs (4 x 100 ul virüs stok solüsyonu + 29.6 ml besi) ile desteklenmiş MEF büyüme orta ekleyin. Orta hatta dağılımını sağlamak için çanak hafifçe sallayın. 37 ° gecede hücreleri ° C'de ve% 5 CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Doksisiklin İndüklenmiş yeniden programlanması</p><ol><li> 20-24 saat sonrası transdüksiyon, (450 ml Nakavt DMEM 50ml ES hücre kaliteli buzağı serumu, 5 ml penisilin / streptomisin ile desteklenmiş, 200 xg'de 5 dakika santrifüj transduced hücreleri trypsinize ve ES / iPS büyüme ortamında tekrar süspansiyon 5 ml 200 mM L-glutamin, 0.5 ml β-merkaptoetanol ve 25 ul LIF). Tohum (2.5 x 10 hücre kültürü çanak boyutu için uygun bir konsantrasyon MEF transduced⁵ 10 cm, verimlilik deneyler ve koloni izolasyonu yeniden programlama için çanak ve 2 x 10 başına hücreleri⁴ ICC deneyler için 4 kuyucuğu başına hücre). 37 ° C ve% 5 CO gece inkübe₂. Not: gelecek analizi için sıvı nitrojen içinde kalan tüm transduced hücrelerinin dondurularak muhafaza edilebilir.</li><li> Orta aspire ve ES / iPS orta taze hazırlanmış ve (biz de bir negatif kontrol olarak DOX olmadan orta) 2 mcg / ml nihai konsantrasyonu doksisiklin ile takviye ile değiştirin. 37 ° C ve% 5 CO inkübe₂.</li></ol><p class="jove_title"> 3. İletimi Verimlilik İmmünositokimyasal Analizi</p><p class="jove_content"Post-doksisiklin indüksiyon> 48 saat, immünhistokimya (ICC) tarafından transdüksiyon etkinliğini belirlemek. 4 kuyucuğu replated hücreler ICC test yürütmek. Aşağıdaki protokol listelenen tüm birimleri hücre kültürü tabak büyüklüğüne göre ayarlanmalıdır.</p><ol><li> (Mg olmadan hücreler PBS ile hafifçe bir kez yıkayın^{2 +} + Veya Ca^{2 +}).</li><li> 500 oda sıcaklığında 15 dakika süreyle PBS içinde 0.5 ml% 4 paraformaldehid ul hücreleri sabitleyin.</li><li> Hafifçe iki kez hücreler PBS ile yıkayın.</li><li> Buz PBS içinde% 0.2 Tween ® -20 500 ul ekleyerek hücreleri Permeabilize. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li><li> Hafifçe iki kez hücreler PBS ile yıkayın.</li><li> Oda sıcaklığında bir saat için 200 ul engelleme tampon ile non-spesifik bağlama engelleyin.</li><li> 4 gecede 200 ul spesifik primer antikor ile hücreleri inkübe ° C (Oct4 kullanılan Klf4, Sox2 ve c-Myc).</li><li> Hafifçe iki kez hücreler PBS ile yıkayın.</li><li> (Eşek Eşek anti-Tavşan rodamin konjuge anti-Keçi plakaları ışıktan korunması, hücrelerin oda sıcaklığında 1 saat süreyle 200 ul ikincil antikor ile inkübe AlexaFluor ® 594 konjuge, Eşek anti-Mouse rodamin konjuge ve Eşek karşıtı -Tavşan rodamin konjuge).</li><li> Hafifçe iki kez hücreler PBS ile yıkayın.</li><li> Ekle DAPI (nihai konsantrasyonu PBS içinde 2 mcg / ml) ve çekirdekleri görselleştirmek için 10 dakika inkübe edin.</li><li> Hücreler PBS ile hafifçe yıkayın.</li><li> Görüntüleme ters bir floresan mikroskop kullanmadan önce anti-solmaya Aqua-Mount ekleyin.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Yalıtma ve genişleyen iPS Hücre Kolonileri</p><ol><li> Yeniden programlama sürecini başlatmak sonra (2. bölümünde açıklandığı gibi), kültürleri izlemek ve orta her 48 saatte bir değiştirin. Biz ilk oniki gün boyunca kültür hücreleri doksisiklin içeren orta ve ardından iPS koloniler elle DOX bağımsız olacaktır genişlemesi için aldı sağlamak için orta doksisiklin kaldırıldı.</li><li> Hücre yeniden programlama sürecinin göstergesi morfolojik değişiklikler günlük olarak takip edilmelidir; veya Nanog-GFP/rtTA MEF, monitör morfolojisi ve reprogrammed koloniler tanımlamak için, GFP floresan gibi hücreleri kullanarak. Her deney farklı olacak, ama koloniler genellikle 16 ve 22 gün arasında izolasyonu için yeterince büyük. Bu zaman diliminde tespit Kolonileri sonra genişleme ve analiz için el ile izole edilmiş ve tripsinize olabilir.</li><li> Reprogrammed koloniler izole ve trypsinizing bir gün önce, 5 x 10 bir yoğunluk, gama-ışınlanmış besleyici tabaka MEFS tohumlama 24-plaka hazırlamak⁴ Hücreleri de ortalama. 37 ° C ve% 5 CO gece inkübe₂.</li><li> El her iPS koloni almak ve hücre agrega ayırmak trypsinize. Re-plaka 24 plaka gama-ışınlanmış besleyici tabaka MEFS önceden numaralı seribaşı bireysel kuyularda ES / iPS orta iPS hücreleri. Wells, 2 x 10 yoğunlukta numaralı seribaşı olmalıdır<sup> 5</supIyi> hücre /. 37 ° C ve% 5 CO inkübe₂. Medya her 24 saatte bir değiştirin.</li><li> Büyüme ve GFP floresan için günlük Monitör iPS koloniler. Biz kültürlerin Pasajlanması 6 gün önce kuluçkaya yatmaktadır.</li><li> 24-plaka kuyu düzgün GFP ifade edildiği belirleyin. Iyi GFP ifade Wells, gama-ışınlanmış besleyici tabaka MEFS önceden numaralı seribaşı 4-kuyucuğu tripsinize ve 01:08 geçişli olabilir. Bu plakalar, ICC ve AP boyama pluripotent marker analizi için kullanılabilir.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Pluripotency için İmmünositokimyasal Analizi</p><p class="jove_content"> ICC test 4 kuyucuğu genişletilmiş hücreler üzerinde gerçekleştirildi. Aşağıdaki protokol listelenen tüm birimleri hücre kültürü tabak büyüklüğüne göre ayarlanmalıdır.</p><ol><li> (Mg olmadan PBS ile iki kez hücrelerin nazikçe yıkayın^{2 +} + Veya Ca^{2 +}).</li><li> 0,5 ml buz% 0.2 Tween 20 PBS kişi başına 10 dakika inkübe edin.</li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.</li><li> Oda sıcaklığında bir saat için 200 ul engelleme tampon ile non-spesifik bağlama engelleyin.</li><li> 4 gecede 200 ul spesifik primer antikor ile hücreleri ° C'de (SSEA-1, Nanog ve Oct4).</li><li> Hafifçe iki kez hücreler PBS ile yıkayın.</li><li> Işık (Eşek anti-Fare rodamin konjuge ve Eşek anti-Tavşan rodamin konjuge) uzak tutmak, hücrelerin oda sıcaklığında 1 saat süreyle 200 ul ikincil antikor ile inkübe edin.</li><li> Hafifçe iki kez hücreler PBS ile yıkayın.</li><li> Ekle DAPI (nihai konsantrasyonu PBS içinde 2 mcg / ml) ve çekirdekleri görselleştirmek için 10 dakika inkübe edin.</li><li> PBS ile hücrelerin nazikçe yıkayın</li><li> Görüntüleme ters bir floresan mikroskop kullanmadan önce anti-solmaya Aqua-Mount ekleyin.</li></ol><p class="jove_title"> 6. IPS Hücre Kolonileri Alkalin Fosfataz (AP) Boyama</p><ol><li> Bölüm 4 iPS koloniler de AP faaliyet ticari kitler mevcuttur kullanan ve üretici protokolü takip için analiz edilebilir.</li></ol><p class="jove_title"> Bölüm 7. Temsilcisi Sonuçlar</p><p class="jove_content"> Stemgent DOX Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set iPS hücreleri MEFS yeniden programlamak kullanılabilir. MEFS, transkripsiyon faktörleri Oct4 ifade transdüksiyon sonra, Sox2, Klf4 ve c-Myc doksisiklin ile tedavi edilen hücrelerde tespit olarak yapabilirsiniz (DOX +), fakat çok az veya hiç ifade tedavi edilmezse (DOX-) hücreleri (Şekil 1) tespit olabilir. . Morfolojik değişiklikler tanımlanan koloni kenarları ve üç boyutlu büyüme (şekil 2a) hücre benzeri koloniler daha büyük, daha ES oluşturmak için zaman (bu örnekte DOX tedavi 12 gün) boyunca ilerleyecektir. DOX kaldırıldığı zaman, bazı ES hücreleri gibi koloniler için hücresel morfoloji bir fark reversion yoktur, ancak birçok koloniler iPS morfolojisi (şekil 2a) korudu. Bu iPS kolonileri, aldı ve geçişli, Alkalen Fosfataz (AP), Nanog, Oct4 ve SSEA-1 (Şekil 3) tipik pluripotency işaretleyici ifade gösterilecek. MEF hücrelerinin endojen Nanog lokus Bu deneme için (Nanog-GFP/rtTA MEF hücreleri) ifade GFP kullanılan pluripotency devlet yeniden yazın. GFP ifadesi bu nedenle başarılı bir yeniden programlama (Şekil 3) için bir ön gösterge olarak kullanılabilir.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /<strong> Şekil 1:</strong> İmmünositokimya (ICC) analizi 48 saat sonrası DOX indüksiyon. Solda panel (DOX) DOX indüksiyon olmadan dört transdüksiyon faktörleri ifade için temsili bir negatif kontrol. Çekirdeğini görselleştirmek için DAPI ile boyanmış ilgili antikorlar (kırmızı ile gösterilen) doğru bir şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tarafından teyit edildi.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /<strong> Şekil 2:</strong> Nanog-GFP/rtTA MEFS iPS hücre durumuna Morfolojik dönüşüm. A) gün 22 (D22) 3 gün zamanla iPS koloniler içine sıkıştırma ve MEFS dönüşüm (D3 + Dox) gösteren hücrelerin 100x faz kontrast görüntüleme. DOX 12 gün geri çekildi. Sol üst paneli: 20x negatif kontrol görüntü-DOX plaka. B) 200x faz-kontrast ve vurgulanan gün, GFP floresan görüntüleri 18 post-DOX indüksiyon iPS koloni. C) 200x faz-kontrast ve ek günün GFP floresan görüntüleri 18 post-DOX indüksiyon iPS koloni.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" /<br /<strong> Şekil 3:</strong> IPS koloniler Analizi. (A) Faz kontrast mikroskopi ve bir iPS koloni (200x) AP boyama. (B) Pluripotency işaretleyici analizi: Sol panel, faz kontrast kaplaması GFP reprogramming muhabir ifade ile gösterir. GFP ifade endojen Nanog ifade düzeyini yansıtır. Orta panel pluripotency belirteçler için ICC boyama gösterir. Sağ panel DAPI çekirdekleri (100x) görselleştirmek için boyanma gösterir.</p