Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

<p class="jove_title"> 1 ist. Viral Transduktion von MEFs</p><ol><li> Der Tag vor Beginn der Versuche, Mantel einer 15 cm Zellkulturschale mit 0,2% Gelatine steril in ddH gefiltert₂ O. Die Platte über Nacht bei 37 ° C und 5% CO₂.</li><li> Absaugen der Flüssigkeit aus der Gelatine beschichtete Schale und Samen MEF-Zellen (wir Nanog-GFP/rtTA MEF-Zellen) in einer Dichte von 4×10⁵ Zellen pro Schale. Inkubieren Sie die Zellen in 30 ml MEF Wachstumsmedium (450ml DMEM mit 50 ml FBS, 5 ml 100x nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml 200 mM L-Glutamin und 0,5 ml 55mm β-Mercaptoethanol ergänzt) für 2 Tage bei 37 ° C und 5% CO₂ Bis ca. 80% konfluent.</li><li> Saugen Sie das Medium und 30 ml MEF Wachstumsmedium mit konzentrierter Lentivirus (4 x 100 ul Virus Stammlösung + 29,6 ml Wachstumsmedium) ergänzt. Rock the Schüssel vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Doxycyclin-induzierte Reprogrammierung</p><ol><li> 20-24 Stunden post-Transduktion, trypsinize die transduzierten Zellen, Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten und resuspendieren in ES / iPS Wachstumsmedium (450 ml Knockout DMEM, ergänzt mit 50ml ES-Zell-qualifizierten Kälberserum, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml 200 mM L-Glutamin, 0,5 ml β-Mercaptoethanol und 25 ul LIF). Seed transduzierten MEF ist in einer geeigneten Konzentration für die Zellkulturschale Größe (wir haben 2,5 x 10⁵ Zellen pro 10 cm Schale für die Umprogrammierung Effizienz Experimente und Kolonie isoliert und 2 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 4-Well-Platten für ICC-Experimente). Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO₂. Hinweis: alle verbleibenden transduzierten Zellen in flüssigem Stickstoff für eine spätere Analyse eingefroren werden.</li><li> Saugen Sie das Medium und ersetzen mit ES / iPS Medium frisch zubereitet und ergänzt mit Doxycyclin, um eine endgültige Konzentration von 2 pg / ml (außerdem haben wir noch Medium ohne DOX als negative Kontrolle). Bei 37 ° C und 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Immunzytochemische Analyse von Transduktionseffizienz</p><p class="jove_content"> 48 Stunden nach der Doxycyclin-Induktion bestimmen Transduktionseffizienz durch Immunhistochemie (ICC). Führen Sie ICC Tests an Zellen in 4-Well-Platten ausplattiert. Alle Bände in das folgende Protokoll aufgeführt ist, nach der Zellkulturplatte Größe angepasst werden.</p><ol><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig einmal mit PBS (ohne Mg^{2 +} + Oder Ca^{2 +}).</li><li> Fix die Zellen mit 500 ul 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS.</li><li> Permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 500 ul eiskaltem 0,2% Tween ® -20 in PBS. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS.</li><li> Block unspezifische Bindung mit 200 ul Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur.</li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 200 ul der spezifischen Primärantikörper über Nacht bei 4 ° C (wir Oct4, Klf4, Sox2 und c-Myc).</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS.</li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 200 ul sekundären Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur und schützt die Platten vor Licht (wir Donkey anti-Rabbit Rhodamin-Konjugat, Donkey anti-Goat AlexaFluor ® 594-Konjugat, Donkey anti-Maus-Rhodamin-Konjugat und Donkey anti -Rabbit Rhodamin-Konjugat).</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS.</li><li> Add DAPI (Endkonzentration 2 pg / ml in PBS) und Inkubation 10 Minuten, um Kerne zu visualisieren.</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS.</li><li> Add anti-fade Aqua-Mount vor Bildgebung mit einer invertierten Fluoreszenzmikroskop.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Isolieren und Ausbau iPS Zellkolonien</p><ol><li> Nach dem Starten den Vorgang der Neuprogrammierung (wie in Abschnitt 2 beschrieben), Überwachung der Kulturen und ersetzen Medium alle 48 Stunden. Wir verwendeten Doxycyclin Medium zur Kultur der Zellen für die ersten 12 Tage und anschließend Doxycyclin aus dem Medium entfernt, um sicherzustellen, dass die iPS Kolonien manuell kommissioniert für die Expansion würde DOX unabhängig sein.</li><li> Zellen sind täglich auf morphologische Veränderungen, die auf den Vorgang der Neuprogrammierung überwacht werden, oder bei der Verwendung von Zellen, wie Nanog-GFP/rtTA MEF, Monitor Morphologie und GFP-Fluoreszenz umprogrammiert Kolonien zu identifizieren. Jedes Experiment wird anders sein, aber die Kolonien sind in der Regel groß genug für die Isolierung zwischen 16 und 22 Tagen. Kolonien in diesem Zeitraum identifiziert werden dann manuell isoliert und trypsiniert für die Expansion und Analyse.</li><li> Am Tag vor Isolierung und trypsinizing der umprogrammiert Kolonien, bereiten Sie einen 24-Well-Platte durch Impfen mit gamma-bestrahlten Feeder-Schicht MEFs bei einer Dichte von 5 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO₂.</li><li> Manuell abholen jedes iPS Kolonie und trypsinize der Zellaggregate zu distanzieren. Re-Platte die iPS-Zellen in ES / iPS Medium in einzelnen Wells der 24-Well-Platte mit gamma-bestrahlten Feeder-Schicht MEFs pre-ausgesät. Wells sollte bei einer Dichte von 2 x 10 ausgesät werden⁵ Zellen / well. Bei 37 ° C und 5% CO₂. Ändern Medien alle 24 Stunden.</li><li> Monitor iPS Kolonien täglich für Wachstum und GFP-Fluoreszenz. Wir inkubieren unsere Kulturen für 6 Tage vor Passage.</li><li> Bestimmen Sie, welche Vertiefungen der 24-Well-Platte gleichmäßig, die GFP. Wells, dass eine gute GFP-Expression haben kann trypsiniert und passagiert 01.08 in 4-Well-Platten, die wurden mit Gamma-bestrahlt Feeder-Schicht MEFs pre-ausgesät. Diese Platten können für pluripotente-Marker-Analyse von ICC und AP-Färbung verwendet werden.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Immunzytochemische Analyse für Pluripotenz</p><p class="jove_content"> Unsere ICC Prüfung erfolgte auf Zellen in 4-Well-Platten ausgebaut durchgeführt. Alle Bände in das folgende Protokoll aufgeführt ist, nach der Zellkulturplatte Größe angepasst werden.</p><ol><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS (ohne Mg^{2 +} + Oder Ca^{2 +}).</li><li> Inkubieren in 0,5 ml eiskaltem 0,2% Tween 20 in PBS pro Vertiefung für 10 Minuten.</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.</li><li> Block unspezifische Bindung mit 200 ul Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur.</li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 200 ul der spezifischen Primärantikörper über Nacht bei 4 ° C (wir SSEA-1, Nanog und Oct4).</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS.</li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 200 ul sekundären Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur, hielten sich fern von Licht (wir Donkey anti-Maus-Rhodamin-Konjugat und Donkey anti-Rabbit Rhodamin-Konjugat).</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS.</li><li> Add DAPI (Endkonzentration 2 pg / ml in PBS) und Inkubation 10 Minuten, um Kerne zu visualisieren.</li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS</li><li> Add anti-fade Aqua-Mount vor Bildgebung mit einer invertierten Fluoreszenzmikroskop.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Alkaline Phosphatase (AP) Die Färbung der iPS Zellkolonien</p><ol><li> IPS Kolonien von Abschnitt 4 auch für die AP-Aktivität unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits und nach dem Protokoll des Herstellers analysiert werden.</li></ol><p class="jove_title"> Teil 7. Repräsentative Ergebnisse</p><p class="jove_content"> Die Stemgent DOX Inducible Maus TF Lentivirus Set kann zum MEFs zu iPS-Zellen umzuprogrammieren werden. Nach Transduktion der MEFs, Expression von Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc in den Zellen mit Doxycyclin behandelt werden können detektiert werden (DOX +), aber wenig oder gar kein Ausdruck kann in unbehandelten (DOX-) Zellen (Abbildung 1) erfasst werden . Morphologischen Veränderungen im Laufe der Zeit (12 Tage von DOX Behandlung in diesem Beispiel), um größere, ES-Zell-ähnliche Kolonien mit definierten Kolonie Kanten und dreidimensionale Wachstum (Abbildung 2a) zu generieren Fortschritt. Wenn DOX entfernt ist, gibt es eine deutliche Umkehrung der zellulären Morphologie für einige ES-Zell-ähnliche Kolonien jedoch beibehalten viele der Kolonien ihre iPS Morphologie (Abbildung 2a). Diese iPS Kolonien, beim Aufheben und passagiert, zeigen typische Pluripotenz-Marker Expression von alkalischer Phosphatase (AP), Nanog, Oct4 und SECO-1 (Abbildung 3). Die Art der MEF-Zellen in diesem Experiment (Nanog-GFP/rtTA MEF-Zellen) exprimieren GFP aus der endogenen Nanog Locus verwendet werden, wenn die Pluripotenz Zustand umprogrammiert. GFP-Expression kann daher als eine erste Indikator für eine erfolgreiche Reprogrammierung (Abbildung 3) verwendet werden.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /<strong> Abbildung 1:</strong> Immunzytochemie (ICC) Analyse 48 Stunden post-DOX Induktion. Die weit linke Tafel (-DOX) ist ein Vertreter negative Kontrolle für die Expression der vier Transduktion Faktoren ohne DOX Induktion. Korrekt ausgedrückt Transkriptionsfaktoren wurden durch entsprechende Antikörper (rot dargestellt), mit DAPI angefärbt, um den Kern zu visualisieren bestätigt.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /<strong> Abbildung 2:</strong> Morphologische Umwandlung von Nanog-GFP/rtTA MEFs der iPS-Zelle Zustand. A) 100x Phasenkontrast-Abbildung von Zellen demonstriert die Verdichtung und Umwandlung von MEFs in iPS Kolonien im Laufe der Zeit von Tag 3 (D3 + Dox) bis Tag 22 (D22). DOX wurde am Tag 12 entnommen. Obere linke Tafel: 20x Negativ-Kontrolle Bild-DOX Platte. B) 200x Phasen-Kontrast-und GFP-Fluoreszenz Bilder markiert Tag 18 post-DOX Induktion iPS Kolonie. C) 200x Phasen-Kontrast-und GFP-Fluoreszenz Bilder von zusätzlichen Tag 18 post-DOX Induktion iPS Kolonie.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" /<br /<strong> Abbildung 3:</strong> Analyse der iPS Kolonien. (A) Phasenkontrast-Mikroskopie und AP-Färbung eines iPS Kolonie (200x). (B) Pluripotenz-Marker-Analyse: Linke Tafel zeigt Phasenkontrast-Overlay mit GFP Umprogrammierung Reporter Ausdruck. GFP-Expression spiegelt die endogene Nanog Expression. Mitteltafel zeigt ICC Färbung für Pluripotenz-Marker. Rechte Bild zeigt DAPI-Färbung der Kerne (100x) zu visualisieren.</p