Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов с Четыре фактора транскрипции, доксициклин индуцибельной лентивирусов системы трансдукция

<p class="jove_title"> 1. Вирусный трансдукции MEFs</p><ol><li> За день до начала эксперимента, пальто 15 см клеточных культур блюдо с 0,2% желатина стерильно фильтруют в DDH₂ О. Инкубируйте планшет в течение ночи при 37 ° С и 5% CO₂.</li><li> Аспирацию жидкости из желатина покрытием блюдо, и клетки семенных MEF (мы использовали Nanog-GFP/rtTA MEF клеток) с плотностью 4×10⁵ Клеток на блюдо. Инкубируйте клетки в 30 мл среды роста MEF (450 мл DMEM дополнена с 50 мл ФБС, 5 мл 100x без незаменимых аминокислот, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл 200 мМ L-глутамина и 0,5 мл 55 β-меркаптоэтанол) для Два дня при температуре 37 ° С и 5% CO₂ Примерно до 80% вырожденная.</li><li> Аспирируйте средних и добавить 30 мл MEF роста среде, дополненной сосредоточены лентивирус (4 х 100 мкл исходного раствора вирус + 29,6 мл питательной среды). Рок блюдо осторожно, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Доксициклин Индуцированные Перепрограммирование</p><ol><li> 20-24 часов после трансдукции, trypsinize трансдуцированных клеток, центрифуги при 200 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют в ES / IPS ростовой среде (450 мл Нокаут DMEM дополнен 50мл ЭСК высококвалифицированных телячьей сыворотки, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 0,5 мл β-меркаптоэтанола и 25 мкл LIF). Семенной трансдуцированных MEF по адресу соответствующей концентрации на размер тарелки культуры клеток (мы использовали 2,5 х 10⁵ Клеток на 10 см блюдо для перепрограммирования эффективности экспериментов и колонии изоляции, и 2 х 10⁴ Клеток на лунку в 4-х луночных для экспериментов МУС). Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% CO₂. Примечание: все оставшиеся трансдуцированных клетки могут быть заморожены в жидком азоте для последующего анализа.</li><li> Аспирируйте средних и замените ES / IPS среду приготовить свежую и дополнены доксициклин, чтобы конечная концентрация 2 мкг / мл (мы также добавили среды без DOX в качестве отрицательного контроля). Инкубировать при 37 ° С и 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Иммуноцитохимическая Анализ эффективности трансдукции</p><p class="jove_content"> 48 часов после доксициклин индукцию, определить эффективность трансдукции иммуногистохимии (МУС). Провести тестирование МТП на клетки replated в 4 и пластин. Все тома, перечисленные в следующий протокол должен быть скорректирован в зависимости от размера пластины культуре клеток.</p><ol><li> Мойте клетки мягко сразу с PBS (без Mg^{2 +} + Или Са^{2 +}).</li><li> Устранение клеток с 500 мкл 0,5 мл 4% параформальдегида в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.</li><li> Мойте клетки мягко два раза с PBS.</li><li> Permeabilize клетки путем добавления 500 мкл ледяной 0,2% Tween ® -20 в PBS. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.</li><li> Мойте клетки мягко два раза с PBS.</li><li> Блок неспецифического связывания с 200 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре.</li><li> Инкубируйте клетки с 200 мкл конкретных первичных антител в течение ночи при 4 ° С (мы использовали Oct4, Klf4, Sox2 и с-Myc).</li><li> Мойте клетки мягко два раза с PBS.</li><li> Инкубируйте клетки с 200 мкл вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре, защищая от света пластин (мы использовали Donkey анти-кролик родамина сопряжены, Осел анти-Коза AlexaFluor ® 594 сопряжены, Осел анти-Mouse родамина сопряженной и Осел анти -Кролик родамина сопряжены).</li><li> Мойте клетки мягко два раза с PBS.</li><li> Добавить DAPI (конечная концентрация 2 мкг / мл в PBS) и инкубировать 10 минут для визуализации ядер.</li><li> Мойте клетки осторожно PBS.</li><li> Добавить анти-Fade Аква-гора до визуализации с использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Изоляция и расширение колоний плюрипотентных сотовый</p><ol><li> После инициирования процесса перепрограммирования (как описано в разделе 2), монитор культур и заменить среды каждые 48 часов. Мы использовали доксициклин среде, содержащей в культуру клеток для первых двенадцати дней, а затем последовательно удаляется доксициклина из среды для того, чтобы плюрипотентных колонии вручную выбрал для расширения будет DOX независимыми.</li><li> Ячейки должны контролироваться ежедневно в течение морфологических изменений свидетельствует о перепрограммировании процесса, или когда с использованием клеток, как Nanog-GFP/rtTA MEF, контролировать морфологию и флуоресценции GFP для выявления перепрограммировать колоний. Каждый эксперимент будет отличаться, но колониях, как правило, достаточно большой для изоляции от 16 до 22 дней. Колонии, выявленные в ходе этого срока могут быть выделены и вручную трипсинизировали для расширения и анализа.</li><li> За день до выделения и trypsinizing перепрограммировать колоний, подготовить 24-луночного планшета путем посева с гамма-облучении фидерного слоя MEFs при плотности 5 х 10⁴ Клеток на лунку. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% CO₂.</li><li> Вручную подобрать каждой колонии КП и trypsinize отделить клеточных агрегатов. Re пластины плюрипотентных клеток в ES / IPS среды в отдельных скважинах 24-луночного планшета предварительно отобранный с гамма-облучении фидерного слоя MEFs. Уэллс должны быть посеяны при плотности 2 х 10⁵ Клеток / лунку. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO₂. Изменение средств массовой информации каждые 24 часа.</li><li> Монитор плюрипотентных колоний в день в течение роста и GFP флуоресценции. Мы инкубировать наших культур в течение 6 дней до пассажей.</li><li> Определите, какие скважины 24-луночного планшета равномерно выражения GFP. Уэллс, которые имеют хорошее выражение GFP может быть трипсином и пассировать 1:08 на 4-луночных планшетах, которые были предварительно отобранный с гамма-облучении фидерного слоя MEFs. Эти плиты могут быть использованы для анализа плюрипотентных маркеров МТП А. П. окрашивания.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Иммуноцитохимическая Анализ плюрипотентности</p><p class="jove_content"> Наша МТП Тестирование проводилось на клетках расширен в 4 и пластин. Все тома, перечисленные в следующий протокол должен быть скорректирован в зависимости от размера пластины культуре клеток.</p><ol><li> Мойте клетки мягко два раза PBS (без Mg^{2 +} + Или Са^{2 +}).</li><li> Инкубируйте в 0,5 мл ледяной 0,2% Твин-20 в PBS на скважину в течение 10 минут.</li><li> Мойте клетки мягко три раза PBS.</li><li> Блок неспецифического связывания с 200 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре.</li><li> Инкубируйте клетки с 200 мкл конкретных первичных антител в течение ночи при 4 ° С (мы использовали SSEA-1, Nanog и Oct4).</li><li> Мойте клетки мягко два раза с PBS.</li><li> Инкубируйте клетки с 200 мкл вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре, держась подальше от света (мы использовали Donkey анти-Mouse родамина сопряженной и Осел анти-кролик родамина сопряжены).</li><li> Мойте клетки мягко два раза с PBS.</li><li> Добавить DAPI (конечная концентрация 2 мкг / мл в PBS) и инкубировать 10 минут для визуализации ядер.</li><li> Мойте клетки осторожно PBS</li><li> Добавить анти-Fade Аква-гора до визуализации с использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Щелочной фосфатазы (AP) Окрашивание колоний плюрипотентных сотовый</p><ol><li> Плюрипотентных колонии из раздела 4 также могут быть проанализированы для AP деятельности с использованием коммерчески доступных наборов и следующий протокол производителя.</li></ol><p class="jove_title"> Часть 7. Представитель Результаты</p><p class="jove_content"> Stemgent индуцибельной DOX Мышь TF лентивирус набор может быть использован для перепрограммирования MEFs для плюрипотентных клеток. После трансдукции MEFs, экспрессия транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc могут быть обнаружены в клетках, обработанных доксициклин (DOX +), но мало или совсем не выражение может быть обнаружена в необработанном (DOX-) клеток (рисунок 1) . Морфологические изменения будут прогрессировать с течением времени (12 дней DOX лечения в данном примере) для создания более крупных и ЭСК-подобных колоний с определенными колонии края и трехмерного роста (рис. 2а). Когда DOX удаляется, есть заметные возврат клеточной морфологии для некоторых ЭСК-подобных колоний, однако, многие из колонии сохранили свои плюрипотентных морфологии (рис. 2а). Эти плюрипотентных колоний, при поднятии и пассировать, показ типичных плюрипотентности выражение маркером щелочной фосфатазы (AP), Nanog, Oct4 и SSEA-1 (рис. 3). Тип MEF клетки, используемые в данном эксперименте (MEF Nanog-GFP/rtTA клеток) выразить GFP из эндогенных локус Nanog когда перенесена на плюрипотентности государства. GFP выражение может быть использован в качестве предварительных индикаторов для успешного перепрограммирования (рис. 3).</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /<strong> Рисунок 1:</strong> Иммуноцитохимическая (МУС) анализ 48 часов после DOX индукции. Крайней левой панели (-DOX) является представителем отрицательного контроля для выражения четырех факторов трансдукции без DOX индукции. Правильно выразил транскрипционных факторов были подтверждены соответствующими антителами (показаны красным), окрашивали DAPI визуализировать ядра.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /<strong> Рисунок 2:</strong> Морфологические преобразования Nanog-GFP/rtTA MEFs государству ячейки IPS. ) 100x изображений фазового контраста клеток демонстрируя уплотнения и преобразования MEFs в колонии плюрипотентных в течение долгого времени изо дня 3 (D3 + DOX) в день 22 (D22). DOX был снят на 12 день. Верхняя левая панель: 20x негативный образ управления из-DOX пластины. В) 200x фазового контраста и флуоресценции GFP изображения выделены 18 день после DOX индукции плюрипотентных колонии. С) 200x фазового контраста и флуоресценции GFP изображений дополнительных 18 день после DOX индукции плюрипотентных колонии.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" /<br /<strong> Рисунок 3:</strong> Анализ колонии IPS. () Этап микроскопии контрастность и А. П. окрашивание колонии IPS (200x). (B) плюрипотентности анализа маркера: Левая панель показывает фазового контраста наложения с GFP перепрограммирования репортер выражения. GFP выражение отражает эндогенной экспрессии Nanog уровне. Ближний панель показывает МТП окрашивание на маркеры плюрипотентности. Правая панель показывает DAPI окрашивания для визуализации ядер (100x).</p