Bu protokol, sağlıklı, farklılaşmamış insan embriyonik kök (ES) hücreleri korumak için nasıl kullanılacağını gösterir.
İnsan embriyonik kök (embriyonik kök) hücreler, sağlıklı, farklılaşmamış kültürleri korumak için izlenmeli ve bakım gerekir. En azından, kültürler kayıp besin doldurmak ve istenmeyen farklılaşma faktörleri kültürleri tutmak için tam bir orta değişikliği yaparak her gün beslenen olmalıdır. Küçük bir miktar farklılaşma normaldir ve kök hücre kültürleri bekleniyor olmasına rağmen, kültür rutin elle kaldırma veya diferansiye alanların "toplama" temizlenir olmalıdır. Belirlenmesi ve embriyonik kök hücre kültürleri fazla farklılaşma kaldırarak hücrelerin sağlıklı bir nüfus bakımında temel teknikler vardır.
Embriyonik kök hücreleri ile çalışırken Sterilite her zaman sağlanmalıdır. Biyolojik güvenlik kabini ve tüm ekipman kullanmadan önce temizleyin ve sterilize edin. Tüm reaktifler kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre edilmelidir. , Embriyonik kök hücre kültüründe antiboiotics kullanımı gerekli değildir ve kaçınılmalıdır.
Ayrı bir ortamda belirli bir toplama istasyonu olarak ayarlanmış olmalıdır. Istasyonu için steril muhafaza UV ışık kaynağı, laminer akış kaputu, ya da biyolojik güvenlik kabini ile statik bir muhafaza (PCR iş istasyonu olarak) olabilir. Diferansiye alanların kaldırılır koloniler dikkat çekme istasyonu içindeki bir diseksiyon mikroskobu gereklidir. Statik muhafaza veya biyolojik güvenlik kabini ön cam panel, uygun hava akımı ve kısırlık ödün vermeden paneli üzerinden genişletmek için mikroskop Okülerin izin vermek için değiştirilmesi gerekir.
Hücrelerin sağlıklı embriyonik kök hücre kültürleri korumak için, genellikle her 4-7 gün, en uygun zamanda geçişli olmalıdır. Şu anda koloniler maksimum boyutuna ulaştı ve birleştirme başlangıcı olabilir. Birleştirilmiş koloniler kültür farklılaşma oranını artırabilir. Bölünmüş oranları genelde, 01:03 ve 01:05 arasında kalan kaplama koloniler, büyüme oranı ve kültür koşulları sayısına göre. Overplated koloniler (split oranı çok düşük) muhtemelen erken birleştirme ve onların maksimum boyutuna ulaşmadan geçişli olması gerekir.
2 haftadan daha uzun bir MEF besleyici tabaka Kültürler farklılaşmamış büyüme ve proliferasyonunu destek olacak yeni MEFS geçişli olmalıdır.
Farklılaşma doğal embriyonik kök hücre kültürleri oluşur, küçük bir miktar bekleniyor. Sık sık veya aşırı farklılaşma kültürler uygun bakım almazsanız oluşabilir. Hücrelerin her gün beslenmesi gerekir, pasajlar arasında aşırı çoğalma kaçınılmalıdır. Her zaman taze reaktifler kullanın. Bütün medya, MEFS ve reaktifler farklılaşmamış embriyonik kök hücre büyümesini önlemek için, 14 gün içinde kullanılmalıdır. Nakavt Serum Değiştirme, FBS ve MEFS, reaktiflerin lot kullanmadan önce taranmalıdır. Pasajlanması için önce kaldırılmaz farklılaşmış hücrelerin yeni kültürler transfer olacağını unutmayın. Ayrıca, hücreler 37 ° C mümkün olduğunca az tutmaya çalışın. Hücreleri hücrelerin uzun süre kuluçka edilecektir Isıtılmış bir mikroskop aşamasında çok yararlı olabilir (örneğin mikroskop sahnede veya biyolojik güvenlik kabini) kuluçka dışında geçirdikleri zamanı en aza indirin.
Mikroskop altında embriyonik kök hücre kültürleri gözlemlemek, ilk kolonilerin görünümü bir düşük güç kullanarak (2x veya 5x) amacı genel kalitesi ve boyutu değerlendirir. Potansiyel olarak farklılaşmış hücreleri düşük güç görüldüğü takdirde, daha yüksek bir büyütme objektif (10X) ile farklılaştırılmış morfolojisi onaylayın.
Çıkardıktan sonra hemen farklılaşma, kolonilerin kenarları tırtıklı veya bozuk görünebilir. Kalan farklılaşmamış hücreleri kurtarmak için izin taze orta gecede koloniler inkübe edin. Kültüründe farklılaşmanın etkisi olmadan, bu kalan koloniler normal sayısı hızla artmaya devam edecektir.
Eğer mümkünse, düşük geçiş embriyonik kök hücreler kullanılarak deneyler başlar. Tüm büyük deney öncesi ve sonrası hücreleri Karyotip.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
|
D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | ||
Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final | |
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
|
PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ | |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | Type A, Porcine | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | HyClone | SH300.70.01 | For freezing medium | |
6-well plates | Nunc | 140675 | For general culture | |
4-well plates | Nunc | 176740 | For thawing | |
5 mL glass pipets | Fisher | 13-678-27E | Individually wrapped | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20D | 9” glass |