ヒト胚性幹細胞の文化とメンテナンス

1。メンテナンス：顕微鏡下で観察する文化 37℃のインキュベータからヒトES細胞の一つのプレートを取り外し、顕微鏡にもたらす。 全体的な文化の質を評価するために、2倍または5倍の倍率を使用して、低消費電力でのコロニーを観察します。通常の培地の色、目に見える汚れ、全体のコロニーの大きさ、質および密度の欠如、および、他の観測：次の点に注意してください。 培地の色の変化を観察する。 pHの変化とヒトES細胞との一晩のインキュベーション後の培地中の栄養素の枯渇のために、媒体が"わら"色に赤の色相から変わります。培地が紫表示された場合は、基本的なpHのシフトが発生しました。媒体は非常に黄色が表示された場合、媒体が酸性化している。非常に黄色の培地はよくまたは汚染に非常に過密なコロニーの結果である可能性があります。培地は、常に明確に表示されます。培地中の細胞残渣の一定のレベルは正常ですが、それは曇って見えることはありません。細胞残渣の高レベルが観察されている場合は、文化は健全ではないと汚染されることがあります。 文化は保守や継代を必要としない場合、それらは（セクション2を参照）に供給できるように生物学的安全キャビネットに撮影することができます。 培養物が約10％のコロニーを差別化よりも多く含まれている場合は、セルを手動で差別化された領域（セクション3を参照）を削除して"クリーンアップ"する必要があります。 文化は大規模または密集コロニーが含まれている、またはMEFフィーダー層以上12日間経過している場合、セルは（セクション4を参照）継代してください。 2。摂食hES細胞無菌生物学的安全キャビネット内で、培養皿の蓋を外し、使用済み培地を吸引除去する。ピペットの先端が直接井戸内よりも他の板の任意の部分に触れないようにしてください。汚染の心配がある場合は、新しい、滅菌ピペットに変更。 滅菌ガラスピペットを用いて、各ウェルに加温し、ヒトES細胞培養培地の適切な量を追加します。 6ウェルプレートでの培養のために、ウェルあたり2.5mlの培地を加える。 37℃、5％CO 2で推移するインキュベーターにプレートを返します。 3。ヒトES細胞培養物から差別を削除する成形アルコールバーナーの制御された炎上のヒントでピッキングツールに9インチのガラスパスツールピペットを変換します。ピペットの先端が汚染を防ぐために密封し、培養皿のプラスチックに傷をつけないように丸められることを確認してください。生物学的安全キャビネットまたはピッキングの筐体にUV光源を使用して、使用前にピッキングツールを滅菌する。 差別化の領域を削除します。分化は、多くの場合、通常のエッジに沿って、または中央に孤立したスポットとして、ヒトES細胞のコロニーの一部のみで発生します。コロニーのセクションのみが差別されている場合は、唯一の差別化された領域を削除する必要があります。差別は、しばしば"スティッキー"シートでプレートをオフに持ち上げることができる、そしてそれはピッキングツールの終わりに植民地を通る線を描画することにより、コロニーの残りの部分から分化した細胞を最初に分離すると便利です。 コロニーの部分が分離されると、静かに不要な細胞を分離するためにプレートに沿って、ピッキングツールを滑ります。この過程で植民地の間にあまりにも多くのMEFフィーダー層のを削り取るように注意してください。 分化した細胞のすべてが、プレート（と培地中に浮遊）から削除すると、生物学的安全キャビネットに文化を返します。分化細胞を含む培地を吸引除去し、新鮮なヒトES細胞培養培地と交換してください。 4。継代ヒトES細胞酵素のインキュベーション無菌生物学的安全キャビネット内で、6ウェル培養皿の蓋を取り外し、継代される井戸から使用済み培地を吸引除去する。ピペットの先端が直接井戸内よりも他の板の任意の部分に触れないようにしてください。 滅菌ガラスピペットを用いて、継代される各ウェルに加温し、コラゲナーゼIVの1 mLを加える。 5分間37℃のインキュベーターにプレートを返します。 ヒトES細胞を掻き取りとプーリングコラゲナーゼで細胞をインキュベートした後、顕微鏡下でコロニーを観察。酵素は、コロニーの端で微妙だが目に見える変化を引き起こす必要があります。 生物学的安全キャビネット内で、静かに各ウェルから酵素を吸引し、2.0 mLをヒトES細胞培養用培地と交換してください。 先端わずかに向かって培養プレートと5mLのガラスピペットで最初のウェルに2.0 mlの培地を取る。徐々にメディアのリリース中にプレートの底にピペットに対して垂直に保持する、静かにも渡っピペットチップを滑ります。 こするとpipettiを繰り返しますngの動き3-4倍は植民地のすべてまでもから削除されています。ピースの小さすぎるにコロニーを破壊を避けるために穏やかにピペッティング。細胞が最初に井戸から削除されているときは、よくで内容のままにしても次の細胞を掻き始める。 継代される井戸のすべてが削り取られて、プール滅菌15 mLコニカルチューブの各ウェルからコロニーの部分を含有する培地を。 各ウェルにヒトES細胞培養の培地1mLを加えることによって掻き井戸をすすぐ。これはリンスとコニカルチューブに移す集める。 ピペットで静かにチューブ内の細胞が目的のサイズにコロニーの部分を分割する。 200 × gで5分間、細胞を遠心分離 hES細胞のセルをめっきヒトES細胞は遠心分離している一方で、新しい6ウェルMEFフィーダープレートを準備。細胞株、新しい継代数、および通過の日付：適切なhES細胞の情報をプレートにラベルを付けます。井戸からMEFの培地を吸引除去し、各ウェルに1.0mLのPBSを加える。ゆっくりと渦は井戸の周りにバッファとPBSの洗浄を吸引除去する。各ウェルに1.5 mLのヒトES細胞培養培地を追加し、プレートを横に置きます。 ヒトES細胞を遠心分離が終了したら、生物学的安全キャビネットにチューブを戻す。ゆるく充填された細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引除去する。 ウェル当たり1 mLのヒトES細胞培養の培地は、被めっきするための十分な培地でペレットに細胞を再懸濁します。 6新しい井戸に分割するときは、6 mLの培地でペレットを再懸濁します。 優しくして均等にMEFフィーダープレートの各ウェル準備に細胞懸濁液1 mLを加える。 37℃のインキュベーターにプレートを置き、慎重に均等によく中の細胞を配布する側にバックアップするために前方にプレート、そして側面をスライドさせます。 細胞は37℃で一晩にアタッチすることができます。 5。代表的な結果： 未分化hES細胞は小さく、密集している、と通常は細胞外より大きく、より広がりで構成されています。分化は、コロニー（図1A）内にまたはコロニー（図3B）の間に発生する可能性があります。 異なるmorhopologiesは、顕微鏡下で低倍率で見ることができます。図2aに示すように良好な細胞形態は、単層で成長小さな、すし詰め状態の細胞が含まれています。細胞は分化がほとんどで、清潔で、定義されたエッジを持つ必要があります。図2Bに示すように、細胞は継代のための準備ができて、そして図2Cに示すように細胞が過密している。 図1。ヒトES培養における分化。（）コロニーの間にコロニー（B）分化の分化。 図2。ヒトES文化に見られる形態 。 （A）良好な細胞の形態（B）（C）過密状態の細胞を継代のための準備ができているヒトES細胞。