الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

1. الصيانة : رصد الثقافات تحت المجهر إزالة واحد من الخلايا لوحة HES من الحاضنة 37 درجة مئوية ، وتقديمهم إلى المجهر. مراقبة المستعمرات في انخفاض القوة ، وذلك باستخدام 2X أو التكبير 5X ، لتقييم نوعية الثقافة عموما. لاحظ ما يلي : عادي اللون المتوسط ​​، وغياب أي تلوث مرئية ، عموما حجم مستعمرة ، والجودة والكثافة ، وأية ملاحظات أخرى. ملاحظة يتغير لون المتوسطة. بسبب التغير في درجة الحموضة واستنفاد المواد المغذية في المتوسط ​​بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع الخلايا HES ، سوف تغير من المتوسط ​​الى اللون الاحمر الى اللون "القش". إذا كان المتوسط ​​تبدو الأرجواني ، حدث تحول الرقم الهيدروجيني الأساسية. إذا كان المتوسط ​​تبدو صفراء للغاية ، ويحمض المتوسط. قد المتوسطة الصفراء جدا أن تكون نتيجة المستعمرات مكتظة للغاية في البئر أو التلوث. وينبغي أن تظهر واضحة على المديين المتوسط ​​في جميع الأوقات. على الرغم من مستوى معين من حطام خلية في المتوسط ​​أمر طبيعي ، وينبغي لها أن تظهر أبدا غائما. إذا لوحظ على مستوى عال من حطام خلية ، الثقافة ليست صحية ، ويمكن أن تكون ملوثة. إذا كانت الثقافات لا تتطلب الصيانة أو الركض ، يمكن أن تؤخذ على مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لتغذية (انظر القسم 2). إذا كانت الثقافات تحتوي على أكثر من 10 ٪ تقريبا التفريق المستعمرات ، ينبغي أن الخلايا "تنظيف" من خلال إزالة يدويا مناطق متمايزة (انظر القسم 3). إذا كانت تحتوي على ثقافات المستعمرات الكبيرة أو الكثيفة ، أو الطبقة المغذية MEF أكثر من 12 يوما من العمر ، ينبغي passaged الخلايا (انظر القسم 4). 2. تغذية خلايا HES في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، وإزالة غطاء الطبق الثقافة ونضح المتوسط ​​المستهلك. لا تسمح للطرف ماصة للمس أي جزء من لوحة أخرى غير مباشرة داخل الآبار. إذا كان هناك أي قلق من التلوث ، وتغير إلى ماصة جديدة معقمة. باستخدام الماصة زجاجية معقمة ، إضافة كمية مناسبة من حرارة HES الخلية مستنبت لكل بئر. للثقافات في صفيحة 6 – جيدا ، إضافة 2.5 مل في المتوسط ​​أيضا. عودة إلى لوحة الحاضنة لتبقى عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. 3. إزالة التمايز من الثقافات الخلية HES تحويل 9 بوصة زجاج باستور ماصات في اختيار الأدوات التي صب على نصائح حول اللهب الحارق للرقابة من الكحول. تأكد من أن يتم إغلاق غيض من ماصة لمنع التلوث وتقريبه لتجنب خدش بلاستيكية الطبق الثقافة. تعقيم الأدوات قبل استخدامها التقاط باستخدام مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو التقاط ضميمة. إزالة مناطق متمايزة. التمايز يحدث في كثير من الأحيان جزء فقط من مستعمرة HES الخلية ، وعادة على طول الحواف أو على شكل بقع معزولة في الوسط. إلا إذا كان جزء من مستعمرة هو التفريق ، فقط في منطقة متباينة يحتاج إلى إزالتها. ويمكن التمييز في كثير من الأحيان رفع قبالة لوحة في ورقة "لزجة" ، وأنه من المفيد لأول فصل خلايا متمايزة عن بقية مستعمرة عن طريق رسم خط من خلال مستعمرة مع نهاية أداة التقاط. مرة واحدة يتم فصل أجزاء من مستعمرة ، تنزلق برفق أداة التقاط على طول لوحة لفصل الخلايا غير المرغوب فيها. الحرص على عدم كشط بعيدا الكثير من الطبقة المغذية MEF بين المستعمرات في هذه العملية. عندما تتم إزالة كافة الخلايا متمايزة عن لوحة (وعائمة في المتوسط) ، العودة الى مجلس الوزراء ثقافة السلامة البيولوجية. نضح المتوسط ​​تحتوي على خلايا متمايزة واستبدال الطازجة HES خلية متوسطة الثقافة. 4. الركض خلايا HES انزيم الحضانة في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، وإزالة غطاء الطبق الثقافة 6 – جيدا ونضح المتوسط ​​أمضى من الآبار لتكون passaged. لا تسمح للطرف ماصة للمس أي جزء من لوحة أخرى غير مباشرة داخل الآبار. باستخدام الماصة زجاجية معقمة ، إضافة 1 مل من الرابع إلى كل كولاجيناز تحسنت بشكل جيد لتكون passaged. عودة إلى لوحة الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. القشط وتجمع خلايا HES بعد حضانة الخلايا مع كولاجيناز ، ومراقبة المستعمرات تحت المجهر. ينبغي للانزيم يسبب تغيير خفية ولكن يمكن ملاحظتها في حواف المستعمرة. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، ونضح بلطف الانزيم من كل بئر واستبدالها مع متوسط ​​2.0 مل HES ثقافة الخلية. تلميح لوحة ثقافة قليلا نحوك ويستغرق المتوسط ​​2.0 مل في البئر الأولى مع الزجاج الماصة 5 مل. عقد عمودي الماصة على الجزء السفلي من لوحة ، وتنزلق برفق طرف الماصة عبر بشكل جيد في حين الإفراج عن ببطء المتوسط. كرر القشط وpipettiأوقات الحركة نانوغرام 3-4 حتى كل من المستعمرات قد أزيلت من البئر. الماصة بلطف لتجنب تفكك المستعمرات في صغير جدا من القطع. عندما تم إزالة الخلايا من البئر الأولى ، وترك محتويات في البئر وتبدأ الخلايا كشط قبالة القرن المقبل أيضا. عندما تم كشط كل من الآبار لتكون passaged وحمام سباحة والمتوسطة التي تحتوي على قطع من كل مستعمرة جيدا في أنبوب معقم 15 مليلتر المخروطية. شطف الآبار كشط بإضافة 1 مل من خلية HES مستنبت لكل بئر. جمع هذا شطف ونقل في أنبوب مخروطي الشكل. الخلايا الماصة برفق في أنبوب لتفريق قطع مستعمرة تصل إلى الحجم المطلوب. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غرام × 200 طلاء للخلايا الخلية HES في حين أن خلايا HES في جهاز الطرد المركزي ، وإعداد وحدة التغذية الجديدة MEF 6 – جيدا لوحة. التسمية مع لوحة المعلومات المناسبة الخلية HES : خط خلية جديدة مرور عدد وتاريخ إقراره. نضح المتوسط ​​MEF من الآبار وإضافة 1.0 مل PBS إلى كل بئر. دوامة بلطف عازلة حول الآبار ونضح غسل برنامج تلفزيوني. إضافة 1.5 مل الخلية HES مستنبت لكل بئر ووضع لوحة جانبا. عندما يتم الانتهاء من الخلايا HES الطرد المركزي ، ليصبح أنبوب يعود الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. نضح لطاف ، والحرص على عدم تعكير صفو فضفاضة معبأة الخلية بيليه. Resuspend الخلايا في بيليه مع المتوسط ​​بما فيه الكفاية ل1 مل HES المتوسطة الثقافة في الخلية بشكل جيد لتكون مطلية. عندما resuspend تنقسم الى 6 آبار جديدة ، وبيليه في المتوسط ​​6 مل. بلطف وبشكل متساو إضافة 1 مل من التعليق على كل خلية مستعدة بشكل جيد من لوحة التغذية MEF. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية والشريحة بعناية لوحة الأمام إلى الخلف ، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي على الخلايا في جميع أنحاء البئر. السماح للخلايا لنعلق على 37 درجة مئوية خلال الليل. 5. ممثل النتائج : غير متمايزة خلايا HES صغيرة ، ومعبأة بإحكام ، وعادة ما تتألف من انتشار أكبر وأكثر من الخلايا. ويمكن التفريق يحدث داخل مستعمرة (الشكل 1A) أو بين المستعمرات (الشكل 3B). ويمكن رؤية morhopologies مختلفة تحت التكبير منخفضة تحت المجهر. ومورفولوجيا الخلايا الجيدة ، كما رأينا في الشكل 2A ، ويحتوي على الصغيرة ، والخلايا معبأة بإحكام التي تنمو في أحادي الطبقة. وينبغي أن يكون الخلايا نظيفة ، حواف محددة ، مع قليل من دون تمييز. الخلايا هو موضح في الشكل 2B مستعدون لالركض ، ومكتظة الخلايا هو موضح في الشكل 2C. الشكل 1. التمايز في الثقافات HES : (أ) التفريق بين مستعمرة (ب) التفريق بين المستعمرات. الشكل 2. Morphologies ينظر في الثقافات HES. (أ) جيدة مورفولوجية الخلية (ب) الخلايا HES التي هي على استعداد لالركض (C) زنزانات مكتظة.