Obtener altamente purificada Toxoplasma gondii Los ooquistes por un gradiente de cloruro de cesio discontinua

<p class="jove_title"> 1. Precauciones generales de seguridad cuando se trabaja con<em> T. gondii</em> Ooquistes</p><ol><li> Es importante que siga todas las precauciones de seguridad cuando se trabaja con<em> T. gondii</em> Ooquistes. En la mayoría de los individuos sanos,<em> T. gondii</emInfección> es fácilmente controlado por el sistema inmune, sin embargo, una vida de duración presenta la infección. Las personas inmunodeprimidas son particularmente susceptibles a la toxoplasmosis y no deben manipular<em> T. gondii</em> Ooquistes. Las mujeres embarazadas no deben manipular<em> T. gondii</em> Ooquistes, ya que la infección puede causar defectos de nacimiento graves⁸.</li><li<em> T. gondii</em> Ooquistes sólo deben ser manejados en un área designada y con personal capacitado. Las señales que indican<em> T. gondii</em> Trabajo de ooquistes en curso debe ser enviado a alertar a los demás entrar en el área designada.</li><li> Use equipos de protección personal (EPP), como una bata de laboratorio, bata desechable, guantes desechables, y protección para los ojos o un protector de cara al manejar<em> T. gondii</em> Ooquistes.</li><liCambios> frecuente de guantes son recomendables. No maneje ningún equipo de laboratorio con<em> T. gondii</em> Ooquistes contaminada guantes.</li><li> Siempre use bandejas de metal forrado con un autoclave revestimientos absorbentes desechables cuando se trabaja con<em> T. gondii</em> Ooquistes. Asegúrese de que todos los bastidores, tubos, etc utilizados son desechables o autoclave.</li><li> Todos los<em> T. gondii</em> Residuos deben ser esterilizados en autoclave dos veces por lo menos una hora.</li><li> Todos los equipos no desechables (bastidores, bandejas, etc) también deben ser esterilizados en autoclave dos veces por lo menos una hora.</li><li> Líneas de vacío usado para aspirar líquidos debe estar conectado a una Vacushield ™ filtro para evitar la contaminación de la bomba de vacío.</li><li> Todos los laboratorios afectados banco tapas deben ser desinfectados después de completar el trabajo con<em> T. gondii</em> Ooquistes. Hipoclorito recién hecho el 10% debe ser libremente aplicados a la zona de trabajo y permitió seco. El área entonces se deben enjuagar bien con agua.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Preparación de tampones y soluciones</p><ol><li> Prepare una solución de 1 L 2,2 M de sacarosa mediante la disolución de 752,66 g de sacarosa en 600 ml ddH₂ O. Agitar y calentar suavemente con una placa de agitación se calienta para disolver la sacarosa. Una vez disuelto por completo, alcanzar un volumen de 1 L con ddH₂ O. Esto debe ser seguido por la esterilización en autoclave la solución por lo menos durante 20 minutos.</li><li> Prepare un 1L buffer TE (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 mediante la adición de 6,05 g de Tris-HCl y 3.7 g de EDTA en 700 ml de ddH₂ O, ajustar el pH a 7.2 a continuación, llevar el volumen a 1 L con ddH₂ O.</li><li> Para el gradiente de CsCl, preparar una solución madre de CsCl con una gravedad específica de 1.15 (1.15-CsCl) mediante la adición de 21,75 g de CsCl con 103,25 ml de buffer TE. Para una solución, mezclar 30 ml de TE con 20 ml de 1.15-CsCl. Para la solución B, mezclar 20 ml de TE con 30 ml de CsCl 1,15 y 12,5 l de solución de rojo fenol. Para la solución C, mezclar 10 ml de TE con 40 ml de CsCl 1,15 (Tabla 1).</li><li> Prepare una solución de 1 litro 1 N de hidróxido de sodio (NaOH) por disolución de 40 g de NaOH en 800 ml de padecer esta enfermedad₂ O. Una vez disuelto, alcanzar un volumen de 1 L con ddH₂ O.</li><li> Prepare una solución de L 1 2% (en volumen) de H₂ SO₄ Mezcla de 20 ml de H₂ SO₄ Con 980 ml de padecer esta enfermedad₂ O.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Sacarosa flotar</p><ol><li> Añadir 10 ml de una suspensión fecal de<em> T. gondii</em> Ooquistes, en el 2% H₂ SO₄, En un tubo de 50 ml de centrífuga cónico. Cabe señalar que la suspensión fecal se refiere a las muestras que han sido pre-procesadas a través de un procedimiento de flotación sacarosa como se describió previamente⁸. Cuando las muestras fecales son inicialmente cosechado de los gatos infectados se procesan a través de un flotador de sacarosa como se describe en la referencia 8. Este flotador sacarosa adicional es necesaria para minimizar aún más los desechos fecales prorrogada para el proceso de purificación de CsCl y obtener el más puro<em> T. gondii</em> Ooquistes posible.</li><li> Neutralizar el H 2%₂ SO₄ Mediante la adición de 6 ml (3 / 5 volúmenes) de NaOH 1 N a la suspensión fecal. Mezclar bien por agitación.</li><li> Añadir un volumen igual (16 ml) de sacarosa 2,2 M la creación de una concentración final de 1,1 M a la suspensión fecal y mezclar bien por agitación.</li><li> Cuidado de superposición de la sacarosa / suspensión fecal con 10 ml ddH₂ O usando una pipeta de 10 ml. Centrifugar la suspensión a 1.200 g durante 20 minutos a temperatura ambiente sin ningún freno.</li><li> Recoger cuidadosamente el agua de encima y las capas de la interfase y la transferencia a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml cónicos con la pipeta de la interfase aire-agua sin remolinos de la pipeta. Es importante minimizar el arrastre de sacarosa durante la percepción de la capa de interfase.</li><li> Mezclar el resto de sacarosa / fecal solución pellet por agitación del tubo.</li><li> Repetir los pasos 3.4 y 3.5.</li><li> Lleve el volumen de las dos soluciones de interfase de ooquistes de 50 ml con ddH₂ O y centrifugar los tubos a 2000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li><li> Aspirar el sobrenadante de cada tubo y volver a suspender las pastillas con 5 ml de buffer TE y la piscina de la suspensión de ooquistes juntos. El volumen total combinado debe ser de 10 ml.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Gradiente CsCl</p><ol><li> Prepare un gradiente de CsCl discontinuo en un tubo de 50 ml canto de policarbonato de roble cuidadosamente underlaying cada capa con una jeringa de 50 ml con un calibre 18 con extremos romos, autoclavable, aguja de acero, y una llave de paso de 2 vías. Nota: El rojo de fenol se agrega a la solución B para distinguir fácilmente entre las capas de gradiente (Tabla 1).</li><li> Poco a poco agregue las siguientes soluciones para el tubo en el orden que se indica a continuación. Cabe señalar que el caudal no debe exceder de más de 0,5 ml / seg.<ol><li> 10 ml de la muestra de la suspensión TE / ooquistes</li><li> 8 ml de solución A</li><li> 8 ml de solución B</li><li> 8 ml de solución C</li></ol></li><li> Centrifugar el tubo de Oak Ridge, a 12.000 xg durante 60 min a 4 ° C sin freno. El uso de un rotor de ángulo fijo es aceptable, pero una alta velocidad de balanceo resultados cubo en una mejor separación de los ooquistes de la muestra de la suspensión con un mínimo de frotis de restos fecales en el lateral o el tubo. La extensión de las manchas depende de la composición de la suspensión fecal y por lo tanto puede ser necesario llevar a cabo dos gradientes de CsCl si la suspensión fecal está muy sucio.</li><li> Después de la centrifugación, recoge la banda de ooquistes opaco / blanco que contiene entre las soluciones A y B. Para reducir al mínimo la contaminación con residuos fecales, vaya directamente a la banda de ooquistes sin alterar el gradiente y recoger la interfase de ooquistes con una pipeta de 10 ml. Transferencia de la interfase de ooquistes a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml cónicos. Trate de minimizar la cantidad de solución de CsCl aspirado, mientras que la recogida de los ooquistes de interfase, ya que puede suponer un problema en la granulación los ooquistes durante la etapa de lavado.</li><li> Lave los ooquistes con 30-40 ml de padecer esta enfermedad₂ O. Centrifugar el tubo a 2000 xg a temperatura ambiente durante 10 minutos sin freno. Con cuidado, aspirar el sobrenadante sin perturbar el precipitado de ooquistes. Repita el lavado dos veces más.</li><li> Al final del último lavado, aspirado con cuidado el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de ácido sulfúrico al 2% y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Ooquistes Ahora está listo para su posterior manipulación. La pureza de ooquistes puede ser controlado microscópicamente por la ausencia de restos fecales en la muestra.</li></ol