Получение высокоочищенного Toxoplasma гондий Ооцист по разрывным градиентом цезия хлорид

<p class="jove_title"> 1. Общие меры безопасности при работе с<em> Т. гондий</em> Ооцист</p><ol><li> Важно соблюдать все правила техники безопасности при работе с<em> Т. гондий</em> Ооцист. В большинстве здоровых людей,<em> Т. гондий</em> Инфекция легко контролируется иммунной системой, однако пожизненное результаты инфекции. Иммунодефицитом люди особенно чувствительны к токсоплазмоз и не должны обращаться<em> Т. гондий</em> Ооцист. Беременные женщины также не должны обрабатывать<em> Т. гондий</em> Ооцист, так как инфекция может вызвать серьезные врожденные дефекты⁸.</li><li<em> Т. гондий</em> Ооцист должны выполняться только в указанном месте и с обученным персоналом. Знаки, указывающие<em> Т. гондий</em> Ооцисты ведется работа должны быть вывешены для предупреждения других ввода назначенный район.</li><li> Использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), таких как лабораторный халат, одноразовые халат, одноразовые перчатки, и надлежащей защиты глаз или щиток для лица при обращении с<em> Т. гондий</em> Ооцист.</li><li> Частая смена перчаток рекомендуется. Не справиться с любой лабораторного оборудования с<em> Т. гондий</em> Ооцисты загрязненные перчатки.</li><li> Всегда использовать металлические лотки автоклавируемый выложены одноразовых абсорбирующих лайнеров при работе с<em> Т. гондий</em> Ооцист. Убедитесь, что все стеллажи, трубы и т.д., используемых либо одноразовые или автоклаве.</li><li> Все<em> Т. гондий</em> Отходы должны обрабатываться в автоклаве в два раза, по крайней мере один час.</li><li> Все не одноразовое оборудование (стеллажи, лотки и т.д.) также должны быть автоклавного два раза в течение не менее одного часа.</li><li> Вакуумные линии, используемые для аспирации жидкостей должны быть подключены к Vacushield ™ фильтр для предотвращения загрязнения вакуумного насоса.</li><li> Все пострадавших лабораторном столе-топы должны быть продезинфицированы после завершения работы с<em> Т. гондий</em> Ооцист. Только что составил 10% гипохлорита должны быть применены к либерально рабочей зоне и позволил сухой. Область должна быть хорошо промыты водой.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Подготовка буферов и растворов</p><ol><li> Подготовка 1 л 2,2 М раствора сахарозы путем растворения 752,66 г сахарозы в 600 мл DDH₂ О. Перемешать и тепло мягко использованием нагретой пластине размешать, чтобы растворить сахарозу. После полного растворения, довести объем до 1 л с DDH₂ О. За этим должно последовать путем стерилизации в автоклаве решение, по крайней мере 20 минут.</li><li> Подготовка 1L ТЕ буфера (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА), рН 7,2, добавляя 6,05 г трис-HCl и 3,7 г ЭДТА в 700 мл DDH₂ О, регулировать рН до 7,2 затем довести объем до 1 л с DDH₂ О.</li><li> Для CsCl градиент, готовят исходный раствор CsCl с удельным весом 1,15 (1,15 CsCl) путем добавления 21,75 г CsCl с 103,25 мл буфера ТЕ. Для решения, смешать 30 мл TE с 20 мл 1,15-CsCl. Для решения B, смешать 20 мл TE с 30 мл 1,15-CsCl и 12,5 мкл смеси фенол красный раствор. Для решения C, смешать 10 мл TE 40 мл 1,15-CsCl (табл. 1).</li><li> Подготовка 1L 1 N раствор гидроксида натрия (NaOH), растворив 40 г NaOH в 800 мл DDH₂ О. После растворения, довести объем до 1 л с DDH₂ О.</li><li> Подготовка 1 L 2% (по объему) раствора H₂ SO₄ Смешивания 20 мл H₂ SO₄ С 980 мл DDH₂ О.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Сахароза плавать</p><ol><li> Добавить 10 мл фекальные приостановление<em> Т. гондий</em> Ооцист, в 2% H₂ SO₄, В 50 мл коническую трубку центрифуги. Следует отметить, что фекальные подвески относится к образцам, которые были предварительно обработаны с помощью процедуры флотации сахарозы, как описано выше⁸. Когда фекальных образцов, первоначально найденным на зараженном кошек они обрабатываются с помощью сахарозы плавать, как описано в работе 8. Этот дополнительный поплавок сахарозы необходимо для дальнейшей минимизации фекальные мусора перенесены на CsCl процесс очистки и получения чистейшей<em> Т. гондий</em> Ооцист возможно.</li><li> Нейтрализовать 2% H₂ SO₄ Путем добавления 6 мл (3 / 5 томов) в 1 N NaOH в фекальной суспензии. Хорошо перемешайте на вортексе.</li><li> Добавить равный объем (16 мл) в 2,2 М сахарозы создания конечной концентрации 1,1 М фекальные подвеска и хорошо перемешать на вортексе.</li><li> Осторожно наложения сахарозы / фекальные подвеска с 10 мл DDH₂ Вывод, используя 10 мл пипетки. Центрифуга подвески на 1200 мкг в течение 20 мин при комнатной температуре без тормозов.</li><li> Осторожно собрать топ воды и межфазных слоев и переход на новый 50 мл коническую трубку центрифуги с помощью пипетки с воздух-вода без закрученного пипетки. Важно, чтобы свести к минимуму сахарозы переходящий во время сбора межфазного слоя.</li><li> Mix оставшиеся сахарозы / фекальные решение пули в вортексе трубки.</li><li> Повторите шаги 3.4 и 3.5.</li><li> Принесите объемом два решения ооцисты межфазного до 50 мл DDH₂ O и центрифуги трубы на 2000 мкг в течение 10 минут при комнатной температуре.</li><li> Аспирируйте супернатант из каждой пробирки и ресуспендируйте гранулы с 5 мл ТЕ-буфера и бассейн ооцисты подвески вместе. Общий объединенный объем должен быть 10 мл.</li></ol><p class="jove_title"> 4. CsCl градиент</p><ol><li> Подготовка разрывных CsCl градиент в 50 мл поликарбоната трубки Ок-Ридж, тщательно нижележащих каждый слой с помощью 50 мл шприц с 18 калибра тупыми концами, автоклавируемый, стальные иглы, и 2 способ остановить кран. Примечание: Фенол красный добавляется Раствор В легко отличать градиент слоев (табл. 1).</li><li> Медленно добавьте следующие решения трубки в порядке, указанном ниже. Следует отметить, что скорость потока не должна превышать более чем на 0,5 мл / сек.<ol><li> 10 мл TE / ооцисты подвески образца</li><li> 8 мл раствора</li><li> 8 мл раствора В</li><li> 8 мл раствора C</li></ol></li><li> Центрифуга трубке Oak Ridge в 12 000 мкг в течение 60 мин при 4 ° C, без тормозов. Использование фиксированного угла ротора является приемлемым, но высокая скорость размахивая ведром приводит к лучшему разделению ооцист из суспензии образца с минимальным фекальных мазков мусора вдоль боковой или трубки. Степень мазков зависит от состава фекальной подвески и, таким образом это может быть необходимо для выполнения двух CsCl градиенты, если фекальные подвески очень грязная.</li><li> После центрифугирования, собирать непрозрачный / белый ооцисты содержащие группы между решениями А и В. Чтобы свести к минимуму загрязнение фекальными мусора, перейти непосредственно к ооцисты группы, не нарушая градиента и собирать ооцисты межфазной использованием 10 мл пипетки. Передача ооцисты межфазной на новый 50 мл коническую трубку центрифуги. Постарайтесь свести к минимуму количество CsCl решение атмосферный время сбора ооцисты интерфазе, как это может создать проблемы в гранулирования ооцист во время мытья шаг.</li><li> Мойте ооцист с 30-40 мл DDH₂ О. Центрифуга трубки на 2000 мкг при комнатной температуре в течение 10 минут без каких-либо тормозов. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая ооцисты гранул. Повторите мыть 2 дополнительных раза.</li><li> В конце последней промывки, тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл 2% серной кислоты и хранить при 4 ° С до использования. Ооцист теперь готовы для дальнейшей манипуляции. Ооцисты чистоты может быть проверена микроскопически отсутствие фекальных мусора в образце.</li></ol