Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

Om te werken onder steriele omstandigheden, is het raadzaam om alle stappen in een laminaire stroming kap uit te voeren. 1. Materialen Zenuwweefsel Dissociatie Kit (P) (Componenten: Oplossing 1,2, 3 en 4, Storage Buffer) Pre-Scheiding Filters (Optioneel) Myeline Removal Beads Beta-mercaptoethanol gentleMACS Dissociator C Buizen MACSmix Tube Rotator HBSS (w / o) HBSS (w) Bereid de volgende oplossingen voor het begin van het protocol: Gebufferde Salt Hanks 'oplossing zonder tweewaardige kationen Ca 2 + of Mg 2 + (HBSS (w / o) HBSS, standaard, dat wil zeggen met Ca 2 + en Mg 2 + (HBSS (w) Afhankelijk van het antigeen epitoop van belang in de volgende toepassingen, gebruikt u de Papaïne op basis van zenuwweefsel Dissociatie Kit (P) of het trypsine-based zenuwweefsel Dissociatie Kit (T). Bereid de volgende oplossingen uit de Neural Tissue Dissociatie Kit: Oplossing 2: voeg beta-mercapto-ethanol op 0,067 mM Oplossing 4: los poeder in 0,7 ml Storage Buffer (meegeleverd in de kit), meng (niet vortex) Enzym Mix 1: Pipetteer 1,9 ml Oplossing 2 en 50 ul Oplossing 1 (beide uit kit) in een C Tube en incubeer 10-15 minuten bij 37 ° C. Dit is voldoende om 400 mg van hersenweefsel dissociëren. 2. Dissociatie van de neurale weefsel Weeg hersenweefsel in een buisje met 1 ml HBSS (w / o) Overdracht hersenen van muizen in de C Tube met 1950 pi van voorverwarmde Enzyme Mix 1. (NB: dit protocol is geschreven voor ≤ 400 mg, maar volume van de oplossingen kan geschaald naar maximaal 1600 mg van hersenweefsel per C Tube zijn) Plaats de C-Tube op de gentleMACS Dissociator en start het programma "m_brain_01". Incubeer met rotatie (4 min met behulp van een MACSmix Tube Rotator) gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Plaats de C-Tube op de gentleMACS Dissociator en start het programma "m_brain_02". Tijdens de dissociatie stap voor te bereiden 30 ul van Enzyme Mix 2 per 400 mg van het weefsel door zachtjes mengen 20 ul van Solution 3 en 10 ul van Solution 4. Voeg Enzyme Mix 2 naar de C Tube via het septum afgesloten cap en meng voorzichtig zonder vortex. Incubeer de C Tube met rotatie gedurende 10 min bij 37 ° C in een incubator. Plaats de C-Tube op de gentleMACS Dissociator en start het programma "m_brain_03". Incubeer de C Tube met rotatie gedurende 10 min bij 37 ° C in een incubator. Centrifugeer kort aan het monster te verzamelen op de bodem van de buis. 3. Filtratie Selecteer een filter groot genoeg is om doorgang te laten de cellen van belang. Bijvoorbeeld, Purkinje cellen zijn te groot zijn om door een 30 urn filter, maar Prominin-1 + cellen. Gebruik een suitable1000 ul pipet om de cellen te verwijderen vormen de C buis door de septum-verzegelde dop en toepassen op de Pre-Separation filter op een 15 ml collectie buis. (NB: voor grotere steekproefomvang gebruik maken van een 50 ml collectie buis). Was het filter met 10 ml van HBSS (w). Centrifugeer de gefilterde cellen op 300 xg gedurende 10 min bij RT. Resuspendeer de supernatent in uw medium of buffer van de keuze voor latere aanvragen. Voor het verwijderen van myeline vuil, gebruik Myeline verwijderen Beads. 4. Vertegenwoordiger Resultaat: Zie Figuren 1-3 Figuur. 1 De hersenen dissociatie met de gentleMACS Dissociator resulteerde in 97% levensvatbare cellen, zoals flowcytometrische analyse laat zien. Figuur. 2 licht microscoop beeld van neurosphere vorming na magnetische celsortering met behulp van anti-Prominin-1 microbolletjes na 7 dagen van de teelt in MACS ® NeuroMedium aangevuld met MACS Supplement B27 PLUS. Cellen werden bereid uit CD1 hersenen van muizen (P3) met de Neural Tissue Dissociation Kit (P). Figuur. 3 Myeline puin in single-cell suspensies vermindert aanzienlijk celisolatie, en het verwijderen van myeline puin door Myeline verwijderen Kralen verhoogt de efficiëntie cel scheidingen. Voor MACS Scheidingen met behulp van anti-Prominin-1 microbolletjes, P22 hersenen van muizen werd gedissocieerd met behulp van de Neural Tissue Dissociation Kit (P). Cellen van de single-celsuspensie werden ofwel direct gebruikt voor de scheiding, of werden voorgelegd aan uitputting myeline met behulp van Myeline verwijderen Beads. Vergelijking van de scheiding van monsters zonder en met myeline verwijdering, toont aan dat de zuiverheid hoger is voor monsters met de vorige myeline verwijderen.