Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Um Arbeit unter sterilen Bedingungen, ist es empfehlenswert, alle Schritte in einer Sterilbank durchgeführt. 1. Materialien Neural Gewebedissoziation Kit (P) (Komponenten: Lösung 1,2, 3 und 4, Storage Buffer) Pre-Separation-Filter (Optional) Myelin Removal Beads Beta-Mercaptoethanol gentleMACS Dissociator C Tubes MACSmix Tube Rotator HBSS (w / o) HBSS (w) Stellen Sie folgende Lösungen vor Beginn des Protokolls: Hanks 'Salzlösung ohne zweiwertige Kationen Ca 2 + oder Mg 2 + (HBSS (w / o) HBSS, Standard, dh mit Ca 2 + und Mg 2 + (HBSS (w) Abhängig von der Antigen-Epitop von Interesse in den folgenden Anwendungen verwenden entweder die Papain-basierte Neural Gewebedissoziation Kit (P) oder Trypsin-basierte Neural Gewebedissoziation Kit (T). Bereiten Sie die folgenden Lösungen aus dem Nervengewebe Dissoziation Kit: Lösung 2: add beta-Mercaptoethanol bis 0,067 mM Lösung 4: Das Pulver in 0,7 ml Lagerpuffer (sofern im Kit enthalten), vorsichtig mischen (nicht vortexen) Enzyme Mix 1: Pipette 1,9 ml Lösung 2 und 50 ul Lösung 1 (beide aus Kit) in eine C Tube und Inkubation für 10-15 min bei 37 ° C. Das genügt, um 400 mg des Gehirngewebes zu distanzieren. 2. Dissoziation der Nervengewebe Wiegen Hirngewebe in ein Röhrchen mit 1 ml HBSS (w / o) Transfer-Maus Gehirn in der C Rohr mit 1950 ul vorgewärmtes Enzyme Mix 1. (Hinweis: Dieses Protokoll ist für ≤ 400 mg geschrieben, aber Lösung Volumes können skaliert auf bis zu 1600 mg Hirngewebe pro C Rohr sein) Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm "m_brain_01". Inkubieren mit Rotation (4 min mit einem MACSmix Tube Rotator) für 15 min bei 37 ° C. Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm "m_brain_02". Während der Dissoziation Schritt vorzubereiten 30 ul Enzym Mix 2 pro 400 mg Gewebe durch vorsichtiges Mischen von 20 ul der Lösung 3 und 10 ul Lösung 4. Add Enzyme Mix 2 der C Rohr über das Septum-Dichtkappe und vorsichtig mischen, ohne Verwirbelungen. Inkubieren Sie die C Tube mit Rotation für 10 min bei 37 ° C im Brutschrank. Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm "m_brain_03". Inkubieren Sie die C Tube mit Rotation für 10 min bei 37 ° C im Brutschrank. Kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. 3. Filtration Wählen Sie einen Filter groß genug, um den Durchgang zu den Zellen von Interesse erlauben. Zum Beispiel sind Purkinjezellen zu groß, um durch eine 30 pm Filter passieren, aber Prominin-1 + Zellen. Verwenden Sie einen suitable1000 ul Pipette auf die Zellen zu entfernen bilden die C Rohr durch das Septum verschlossenen Deckel und es auf die Pre-Separation-Filter auf einem 15 ml-Collection-Tube. (Hinweis: Bei größeren Stichproben mit einem 50 ml-Collection-Tube). Waschen Sie den Filter mit 10 ml HBSS (w). Centrifuge die gefilterten Zellen bei 300 xg für 10 min bei RT. Resuspendieren der Überstand in Ihrem Medium oder Puffer der Wahl für spätere Anwendungen. So entfernen Sie Myelin Trümmer, verwenden Myelin Removal Perlen. 4. Repräsentatives Ergebnis: siehe Abbildungen 1-3 Abbildung. 1 Das Gehirn Dissoziation mit der gentleMACS Dissociator führte in 97% lebensfähige Zellen, wie die durchflusszytometrische Analyse zeigt. Abbildung. 2 Light-Aufnahme von Neurosphäre Bildung nach magnetischer Zellsortierung mit Anti-Prominin-1 MicroBeads nach 7 Tagen Kultivierung in MACS ® NeuroMedium mit MACS Supplement B27 PLUS ergänzt. Die Zellen wurden aus CD1 Gehirn der Maus (P3) mit dem Neural Gewebedissoziation Kit (P) vorbereitet. Abbildung. 3 Myelin Trümmer in Einzel-Zellsuspensionen erheblich beeinträchtigt Zellisolation und das Entfernen von Myelin Trümmer von Myelin Removal Perlen steigert die Effizienz Zelle Trennungen. Für MACS Separations mit Anti-Prominin-1 MicroBeads wurde P22 Maushirn dissoziiert mit dem Neural Gewebedissoziation Kit (P). Zellen aus der Einzel-Zell-Suspension wurden entweder direkt für die Trennung verwendet werden, oder wurden eingereicht, um einer Verarmung Myelin mit Myelin Removal Perlen. Vergleicht man die Trennung von Proben ohne und mit Myelin Entfernung, zeigt, dass die Reinheit höher ist für Proben mit früheren Myelin Entfernung.