焦点のCa ^{2 +}過渡検出

パート1：のCa 2 +インジケーター（AMオレゴングリーン488 BAPTA – 1）の調製オレゴングリーン488 BAPTA – 1は、AM粉の少量（50μg）をとして500μlのバイアルで提供されます。粉体へのF – 127ソリューション、30秒間静かに揺れ40μlのプルロニックを追加し、その後、460μlのPSSを追加し、30秒間振とうする最終的な解決には、10μMオレゴングリーン488 BAPTA – 1 AMは、4 ×125μlのアリコートを提供します。 -20℃での光とストアへの暴露を避けるパート2：のCa 2 +ローディング （-20℃）冷凍庫からのCa 2 +インジケーター（オレゴングリーン488 BAPTA – 1 AM）を削除し、室温で解凍することができます。 試験管や水浴の場所でPSSの1mlを取る。秒あたりに現れる約1バブルの速度で95％O 2 / 5％CO 2のバブル。バブラーは、栓、またはパラフィルムで、例えば試験管、に保護する必要があります。 動物から組織を摘出し、、Sylgardライニングペトリ皿に、慎重に結合組織を取り除く。関係なく、平滑筋臓器のタイプの、PSSは10分ごとに交換する必要があり、組織は、（PSS三回を交換するなど）だけでなく、以下の郭清を洗浄する必要があります。輸精管の場合：ティッシュのシートを生産する器官の長さの方法を切削することを検討してください。膀胱用：ドームの上部（前方）に膀胱頸部（後方）から縦方向に開く。 8 LONG mmおよび1 – – 支配的な筋肉の束の方向に切断排尿筋の背側表面に沿って幅2 mmの4つのストリップ、6を準備します。 "事​​前に暖めとバブル"PSSで切除した組織を置きます。 10μMオレゴングリーン488 BAPTA – 1は試験管の午前の125μlを加え、少し振る、手で、ミックスする。 箔で覆われ、バブリングと休暇を再開する。時間は、Ca 2を取るのに十分な組織のために引き継ぎます+インジケーターは、組織と平滑筋の層の厚さのサイズによって異なります。例えば：120分（ラットの排尿筋、マウス輸精管）へ70分（マウス排尿筋、ラットのanococcygeus）。 パート3："Ca 2 +は 、ロードされた"顕微鏡のための組織の準備組織のピニング慎重になることが組織の自発運動（相対的に無傷の組織から平滑筋細胞のイメージングのプロパティ）を最小限に抑え、組織のフラットな作品として撮影するのに適したサイト（の位置を容易にするために必要です。二次元ではなく3つ）で調査した。 少なくとも5分間バブリングPSSの組織をすすいでください。 平らなシートを形成するために組織を（わずかに）ストレッチ、Sylgardライニング準備皿にマウントします。 "ピン"として25から50ミクロン径の銀線の代わりに短い長さを使用し、斜めに挿入し、目標を傷つけることがある長い"ピン"を使用することは避けてください。 PSSは、皿のSylgardが並ぶエリア（これは、灌流の開始時に、PSSで覆われて大面積を招く場合があります）から逃れることがないように注意しながら、顕微鏡のステージ上に準備皿を置きます。 PSSで準備を表面かん流するために、ポンプのスイッチを入れる。時間当たり100mlの速度は、しばしば採用されている。 ヒーターユニットに切り替えます。 準備の料理（その基盤上に磁石で金属片にそれぞれ貼付）に流入し、流出管及び温度プローブを置きます。流出管の先端の高さは、PSSの深さを決定します。流出が実際に（それは時々最初にしないとして）PSSを除去していることを確認するように注意してください。 、所望の温度に到達するためのヒータユニット上に、例えば33から35℃を温度を設定する組織は、少なくとも10分間平衡させる。 パート4：画像へのサイトの選択励起光源への暴露はインジケータが退色しますので、一度に数秒以上使用しないようにしてください。 低消費電力を目的とし（10倍または20倍）平滑筋を表示し、監視するために適切な領域を識別するために、青色光で励起する、落射蛍光使用。運動（最小限でなければなりません）とフィールドでの平滑筋細胞の数：に基づいてサイトを選んでみてください。明るい"構造は"画像の検出アルゴリズムで"偽陽性"の高い数を引き起こすことがありますので、（例えば）散在上皮細胞または線維芽細胞の数が多いサイトにアクセスしないように。 より高い電力の目標（40倍）に切り替えます。 ステージや平滑筋細胞（の）ので、光軸を回転させる（高速走査軸に、すなわち平行）、水平位置。 パート5：共焦点顕微鏡共焦点顕微鏡は、"設定"する方法の詳細については、各顕微鏡の種類に固有のものですが、重要な考慮事項は次のとおりです。スピード（5 Hzの最小はほとんどのCa 2 +過渡に必要とされる）、フィールドの解像度とサイズ（速度とオフ取引されどち ​​らも）。次のプロトコルのいくつかは、ライカSP2直立共焦点顕微鏡に固有のものです。典型的なプロトコルです：5 Hzの（256 × 256ピクセル、約100 ×100μmである。）で取得した100フレームのシリーズ、または13.5 Hzの（256 × 64ピクセル、約100 ×25μmと。）。走査ヘッドは双方向に移動する（取得速度を最大にする）と、行ごとに1000 Hzで取得するように設定。 1つの"エアリーディスク"にピンホールを閉じて。 AOTFで25〜35％の間レーザー（488 nm）のパワーを設定します。この値は、明るさと光退色との間のトレードオフです。 （後者は長時間録音時に特定の問題である。） "治療"あたり6つのサイト – 六つのサイトあたりのシリーズ、および4を取得する。かなりの退色は、実験者はこのから逸脱する可能性がありますが、それは、事前に薬剤（すなわち"コントロール"）とポスト薬剤同じ6つのサイトを監視することを目的とするのが一般的です。 それは、"タイムコントロール"が実行されることのCa 2 +イメージングとが不可欠です。 第6部：分析のための準備 http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html：からイメージJをダウンロードしてインストールします。プラットフォーム固有のバージョンをダウンロードしてから、http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jarから最新のimageJ.jarファイルをダウンロードし、古いファイルを置き換えることにより、最新のバージョンにアップデートする。アップルMacユーザー：それは徐々に実行される場合は、アップル（http://www.apple.com/macosx/features/java/）から入手可能なJava仮想マシン（JVM）の最新バージョンを使用していることを確認。 からExcel_writer.jarダウンロード：http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.htmlをしてプラグイン[ディレクトリ]> jarファイルのディレクトリにインストールします。 ; JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class：以下のファイルをPluginsディレクトリにコピーします。プラグインを使用して、これらの各スクリプトをインストール[メニュー]>マクロ>のインストール… ImageJの機能。 私たちは、ライカSP2共焦点顕微鏡、ソフトウェア内の単一の表示可能な"映画"として、各系列を生成するためのソフトウェア（ライカLCS）を使用しますが、個々のフレームとして保存されます。シリーズにフレームを再構成するために：（i）は再構築されるすべての"フレーム"は、単一のフォルダ（例："DataFolder>原告"）になっていることを確認します。 （ⅱ）プラグイン[メニュー]>マクロ> Leica_SP2_Stackerを選択してください。ルートディレクトリ（例えば'DataFolder'）を選択してください。ドロップダウンリスト（たとえば、'TIFFを/"）から目的のフォルダを選択します。出力ディレクトリを選択するか、新しいものを（例えば、'DataFolder>スタック"）を生成します。スクリプトは、個々のフレームからシリーズを再構築します。 パート7：運動を補正画像化されたサイトの動きが良くピンニングと最小化と均一に延伸組織されることがありますが、一部の平滑筋臓器は単独でピニング慎重で廃止することができる自発的な収縮を示す。ここでは、整列またはシリーズ内でのフレームと一致して自由に利用可能なアルゴリズムの使用を説明しています。 "StackReg"（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）と"TurboReg"（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）をダウンロードしてください。 プラグインを使用してプラグインディレクトリにそれぞれをインストールする>マクロ>のインストール… （>開くをファイル…）処理されるようにスタックをロードしてから、明らかに興味のある分野を示していますフレームに移動します。他のフレームは、この基準のフレームに配置されます。 プラグイン>スタック> StackReg。最も効果的であるかを判別するために別の"変換"（すなわち翻訳、リジッドボディ、スケール回転、アフィン）のそれぞれを試してみてください。 （更なる詳細：http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/） パート8：粒子の検出アルゴリズム各"サイトが"イメージングのために、要因は、Ca 2 +トランジェントの検出に影響を与えることが異なります。各サイト（"粒子のパラメータ" – 詳細下記）の特定の特性を測定することにより、検出の処理が促進される。このようにサイトごとに、一つは、"比率のしきい値"と"セルのエッジのしきい値'減算のしきい値"を計算します。 プラグインの[メニュー]>マクロ>のインストール… …と"JNCT0.08Release.ijm"を選択します。 プラグインの[メニュー]>マクロ>負荷スタック（ショートカット：L）。シリーズを選択して、パーティクルのパラメータを計算します。 A.減算のためのしきい値（=バックグラウンド） あなたが"背景"であると信じるもの以上の矩形ROIを選択してください。 尺度（ショートカット：M）。平均値ダウンに注意してください。 B.比率の計算しきい値長方形を選択します。セル（複数可）の光学的に平坦な領域の周りROI。 尺度（ショートカット：M）。平均値と標準偏差を書き留めます。 さらに2回繰り返し、ORは"シフト"を押して一度に3つのボックスを描画することができます。 3 /のサイトを複製するから値を平均し、=（1 + SD /平均値）× 32の比率のしきい値を計算し、書き留めておきます。 C.セル端のしきい値画像>スタック> Zプロジェクト…投影タイプを選択します："平均強度を" 画像>>しきい値を調整します。 黒と白]を選択します。 "下"の定義（上側のスライダ）を制限すると、対応する値（スライダーの右側にある）を書き留めておきます。黒の領域で発生するイベントだけがカウントされます。 "リセット"をクリックします。 スタックを分析（ショートカット：2） この段階で一つのシリーズを選択し、'最初のファイルを"IEと'最後のファイルは、"同じでなければなりません。 、"比率のしきい値"と"セルのエッジのしきい値'を減算するためのしきい値"の値を入力します。それらのデフォルト値で他の設定のまま。 このアルゴリズムは、処理系が左側に示されているデュアルペインのウィンドウと右上の元を生成します。慎重に目で見えるイベントは、、検出されていないもので偽陽性と機会の数を評価するためにこの通過。 Ca 2 +のより正確な検出+トランジェントを得るためにそれは少し"粒子のパラメータ"のいくつかを調整する必要があります。プロセスは少し"ヒットとミス"を思わ最初の試みでもありますが、人はすぐにパラメータが鍵となるものとして感じを取得します。 各シリーズの場合、アルゴリズムは、Excelファイルを生成することを検出したイベントの詳細特性（振幅、面積や位置など）。 "偽陽性" – このExcelファイルから、手で、削除される可能性がある – アルゴリズムの出力は（例えばステップ8.17）という画像ファイルを確認して識別される。