Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel
Summary
Details methoden voor hoge-resolutie Ca<sup> 2 +</sup> Beeldvorming van het gladde spierweefsel in geïsoleerde organen, zoals: de voorbereiding van het weefsel, beeld-acquisitie en data-analyse.
Abstract
Ca 2 + beeldvorming van het gladde spierweefsel geeft inzicht in cellulaire mechanismen die niet kan resulteren in veranderingen van de membraanpotentiaal, zoals de vrijlating van Ca 2 + van interne winkels, en maakt het mogelijk meerdere cellen tegelijkertijd worden gecontroleerd om, te beoordelen bijvoorbeeld, koppeling in syncytieel weefsel. Subcellulaire Ca 2 + transiënten komen vaak voor in de gladde spieren, maar zijn moeilijk nauwkeurig te meten, vanwege de problemen veroorzaakt door hun stochastische gebeurtenis, dan een vaak breed gezichtsveld, in een orgaan dat het gevoelig zijn voor contract. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een serie van beeldvorming protocollen en analyse routines om vervolgens te verwerven en te analyseren, op een geautomatiseerde manier, de frequentie, de locatie en de amplitude van dergelijke gebeurtenissen. Hoewel deze aanpak kan worden toegepast in een andere context, onze eigen werk bestaat uit het opsporen van de lokale purinerge Ca 2 + transiënten voor het lokaliseren van de zender release met submicron-resolutie.
ATP is uitgebracht als een cotransmitter van de autonome zenuwen, waar het bindt aan P2X1 receptoren op de gladde spieren van de detrusor en de zaadleider. Ca 2 + komt in de gladde spieren, wat resulteert in purinerge neuroeffector Ca 2 + transiënten (NCTS). Het brandpunt Ca 2 + transiënten kan de optische controle van de neurotransmitters in een manier die veel voordelen ten opzichte van elektrofysiologie heeft. Afgezien van de sterk verbeterde ruimtelijke resolutie, optische recording heeft het extra voordeel dat de opname van de zender vrijlating uit een groot aantal te onderscheiden locaties tegelijk. Bovendien is de optische vlak van focus is makkelijker te onderhouden of te corrigeren tijdens de lange opname-serie dan is de herpositionering van een intracellulaire scherp micro-elektrode.
Samengevat, is een methode voor de beeldvorming van Ca 2 + fluorescentie geschetst waarin de details van de voorbereiding van de weefsel, en de verwerving en analyse van gegevens. Schetsen we het gebruik van meerdere scripts voor de analyse van dergelijke Ca 2 + transiënten.
Protocol
Discussion
Keuze uit fluorescerende Ca 2 +-indicator
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM werd gekozen als de Ca 2 +-indicator, omdat het (i) is licht in vergelijking met andere indicatoren (bijv. Fluo-4 en Calcium Groen) 1, (ii) is gevoelig voor fysiologische veranderingen in Ca 2 +-concentratie met een K D van dezelfde orde van grootte 1 op de intracellulaire Ca 2 +-concentratie [Ca 2 +] i (bijvoorbeeld van vas deferens 2), (iii) laadt een groot aantal gladde spiercellen, waardoor gladde spiercellen koppeling te worden gecontroleerd. Echter, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM is een non-ratioable Ca 2 +-indicator, en als zodanig niet gemakkelijk kan worden gebruikt om de absolute bepalen [Ca 2 +] i. Bovendien kan het ook buffer Ca 2 + indien aanwezig in hoge concentraties en wordt verzadigd met een hoge amplitude veranderingen in [Ca 2 +] i.
Remming van spontane contractiliteit
De spontane contractiliteit van de gladde spieren organen kunnen farmacologisch worden verminderd, bijvoorbeeld door het blokkeren van de beweging van Ca 2 + door de L-type Ca 2 +-kanalen (bijv. door: nifedipine 3; diltiazem 4). Merk op dat deze medicijnen sterk zal de amplitude van whole-cell Ca 2 + flitsen / transiënten te verminderen.
Contractie van de zaadleider resultaat van een combinatie van voornamelijk purinerge en noradrenerge neurotransmissie. Focus Ca 2 + transiënten in dit weefsel zijn echter ongevoelig voor noradrenerge receptor blokkade (bijv. α een adrenoceptor, door prazosine 5), zodat beweging kan worden verlaagd zonder dat dit invloed focale Ca 2 + transiënten.
Als alternatief kan samentrekking worden voorkomen 'downstream' door de remming van myosine lichte keten kinase, bijvoorbeeld door wortmannin 6.
Conclusies
Monitoring Ca 2 + fluorescentie bij submicron resolutie is een krachtige techniek om de post-junctionele effecten van neurotransmitters 5,7 bestuderen en het vrijkomen van Ca 2 + uit interne winkels (bijvoorbeeld 'vonken' 8). De analyse van Ca 2 + transiënten het gebruik van de beschreven methode is hier rendabel in vergelijking met commercieel verkrijgbare beeldanalyse pakketten en maakt het mogelijk op maat gemaakte analyse door middel van op maat geschreven Java-plug-ins voor ImageJ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De Wellcome Trust heeft financiële steun verleend (VIP Award uit aan JSY en 074.128 Research Fellowship aan KLB). Medical Research Council studententijd aan RJA
Leica_SP2_Stacker, een algoritme gebruikt om de TIFF's importeren voor 'reconstructie' in een reeks, is gebaseerd op Leica_tiff_sequence, een plugin voor het lezen van Leica SP2 TIFF's in ImageJ, ontwikkeld door Tony Collins en gebruikt met zijn toestemming.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg en TurboReg, zijn algoritmen die worden gebruikt om te corrigeren voor verplaatsing van weefsel, op basis van Th venaz en collega's (1998) 9.
Excel_writer.jar werd geschreven door Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
JNCT0.08JoVE.ijm, het deeltje detectie-algoritme, is gebaseerd op een algoritme geschreven door KL Brain en eerder vijf gedetailleerd.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg | |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO | |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica | |||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport | M-VW-3046-OPT-012140 | ||
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
References
- Haugland, R. P., Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).
- Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse. Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).
- Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. J Physiol. 150, 273-286 (2001).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 564, 201-212 (2005).
- Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens. J. Physiol. 541, 849-862 (2002).
- Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).
- Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder. J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).
- Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, 633-637 (1995).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).
