בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

מגוון רחב של בלוציפראז שורות תאים סרטניים לבטא יכול לשמש למחקר טרום קליניים במודלים של העכבר. תאים אלה הם כאמור התרבות הפתוגן ללא קפוא, אשר בקלות לגדול בתקשורת סטנדרטי ללא צורך סמנים הבחירה. לצורך ניסוי שלנו, אנו נשתמש 4T1-luc2 תא Murine החלב הגידול קו, המבטא את הגן בלוציפראז המשמש כאינדיקטור אופטי של ביטוי גנים או tumorgenesis in vivo. אנו נשתמש בביטוי בלוציפראז כדי לעקוב אחר גדילת הגידול הראשוני הלא פולשני, אבל הם יכולים לשמש גם כדי לאתר ולעקוב אחר גרורות. פעילות בלוציפראז יש לוודא לפני הזריקה, ועל מנת לעשות זאת, בבקבוק ומחוברות 90% נאסף על ידי trypsinization, ואז ספרה. 50,000 תאים לוותר אז גם אחד של צלחת microtiter ו דילולים סדרתי מבוצעות. Luciferin מתווספת בארות 150ug לכל מ"ל וטופחו במשך 2 דקות. Microplate ניתן הדמיה ב IVIS או בקורא צלחת זורח לקבוע רמות הביטוי. קו זה מבטא את התא עד 6500 פוטונים לכל תא לשנייה, אבל כל רמת הביטוי מעל 500 פוטונים לכל תא לשנייה ניתן הדמיה בהצלחה in vivo. עכשיו יש לנו את התאים לפעילות אופטימלית, נוכל להמשיך לשלב הזרקה תת עורית. על מנת להקל על איתור אופטימלי של הגידול, אנו משתמשים זן athymic immunocompromised עכבר בעירום. לפני הזריקה, בעלי חיים מורדמים אפקט עבור הרדמה עמוקה. הבא אנו להזריק עד 250,000 תאים 100ul PBS מוזרקים תת עורית לתוך האגף. טען התאים מזרק 1 מ"ל ולצרף מחט מד 26. הרם את העור בעדינות עם מלקחיים לעשות "האוהל" ו להזריק את התאים בבסיס. התאים מוזרקים החדש ניתן הדמיה מיד. בכל פגישה הדמיה לסך של 150 מ"ג של Luciferin לכל ק"ג משקל גוף מנוהל באמצעות מכן שתי זריקות לתוך חלל הצפק. במחקר זה, בעלי חיים הם צילמו 10 דקות לאחר ההזרקה Luciferin כדי להבטיח זרימה פוטון עקבי. אנחנו נראה לך את זה לשלב הבא. Luciferin קינטיקה יכול להשתנות מיום ליום. במודל זה בפרט, למדידת 10 דקות לאחר ההזרקה Luciferin נתן תוצאה בטווח של השתנות של 15%. לצורך ניסוי שלנו נשתמש ספקטרום IVIS במערכת הדמיה vivo משתמש גב המכשיר דליל תשלום מצמידים מקורר -90 ° C כדי להשיג רגישות מרבית. כדי לתמוך quantitation מוחלט, מערכת האמצעים תשלום כהה בזמן כלפי מטה ומפעיל עצמית כיול במהלך האתחול. כדי להפעיל את ההדמיה, לאתחל את מערכת IVIS (לחיצה אחת) וכן להגדיר את הפרמטרים הדמיה לצורך הניסוי. בחר את שדה הראיה עבור מספר בעלי חיים להיות הדמיה. עד 5 בעלי חיים יכול להישמר במכשיר באמצעות סעפת הרדמה נפרד. הבמה ב 37 ° C קבוע כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים. נמל א.ק. ג ניתן לפקח על בריאות בעלי החיים במהלך הליכי מלחיץ. לחיות תוכנה תמונה, זמן חשיפה, f-לעצור פיקסל binning יכול להיות מותאם לפי רמת הביטוי של הקו הסלולרי. הגדרות אלו ניתן לשנות בכל עת במהלך ניסוי מבלי להשפיע על תוצאה כמותית. IVIS רוכש תמונה צילום של החיה תחת אור לבן אות bioluminescent או פלורסנט כמותי, אשר כיסו על התמונה. האות bioluminescent מתבטא פוטונים לשנייה מוצגת המפה עוצמה. להציג את התמונה מותאם מספקים ניגוד ברזולוציה אופטימלית של התמונה מבלי להשפיע על quantitation. הארה מן התאים ניתן למדוד באתר באמצעות הזרקה לאזור של כלי הריבית. נתוני המדידה מוצגים בטבלה יחד עם כל הפרמטרים של הניסוי הנוגעים ללכוד את התמונה ניתן לשמור או לייצא לניתוח מספר תמונות ניתן לרכוש והשוו במחקרים ארוכי טווח המכסים שניות או חודשים בהתאם לאופי הניסוי. אנו מודדים שטף פוטון מן הגידול באפס זמן לפקח למשך 4 שבועות עם הדמיה דו שבועי במרווחים. השטף פוטון מן הגידול הוא יחסי למספר תאים חיים להביע בלוציפראז כך פליטת אור בקורלציה ישירה עם גודל הגידול. בשלב ההשרשה 5 ימים שלאחר הגידול עדיין לא מוחשי אבל התאים ניתן לכמת באמצעות פליטת אור ואת הגידול נתפסת להיות גדל באופן פעיל. בשלב זה את האות פליטת אור הרבה strongeר ' זמן חשיפה, f-לעצור binning פיקסל יכול להיות מותאם כך התמונה ברורה המצלמה אינה להרוות. IVIS מפצה באופן אוטומטי את השינויים אוסף כל כך קל מדידות אלה ניתן בהשוואה לאלה שנאספו מוקדם ומאוחר בניסוי. בשעה 7 ימים שלאחר השתלת גידולים הם מוחשי בפעם הראשונה מדידת פליטת אור יצרה כבר 7 ימים של נתונים. בשלב ההשתלה 28 ימים הודעה, גידולים הופכים נמקי ותאי מתחילים למות. גודל הגידול מוערך על ידי קליפר המדידה אינה משתנה במידה ניכרת, אך הארה מן הגידול יקטן המעיד על מוות של תאים. מדידות Caliper ומדידה פליטת אור יכול להיות נמשך עד הסיום אנושי הוא הגיע. נמק גידול עקב המשטרים היפוקסיה או טיפול תסומן על ידי פליטת אור מופחת, גם אם הם לא להפחית את מסת הגידול.