En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

Una amplia variedad de luciferasa que expresan las líneas celulares de cáncer puede ser utilizado para la investigación preclínica en modelos de ratón. Estas células se proporcionan como una cultura congelada libre de patógenos, que rápidamente crecerá en los medios de comunicación estándar, sin necesidad de marcadores de selección. Para nuestro experimento, vamos a utilizar el 4T1-luc2 murino línea de células tumorales mamarias, que expresa el gen de la luciferasa, que sirve como un indicador óptico de la expresión génica o tumorgenesis in vivo. Vamos a usar la expresión de luciferasa para observar el crecimiento del tumor primario, de forma no invasiva, pero también se puede utilizar para localizar y controlar las lesiones metastásicas. La actividad luciferasa debe ser verificada antes de la inyección, y con el fin de hacer esto, un frasco de 90% confluentes se cosechan por tripsinización y contaron. 50.000 células se entrega en un solo pozo de una placa de microtitulación y diluciones seriadas se llevan a cabo. Luciferina se añade a los pozos de 150ug por ml y se incubó durante 2 minutos. La microplaca se pueden leer en IVIS o un lector de placas luminiscentes para determinar los niveles de expresión. Esta línea celular expresa hasta 6500 fotones por células por segundo, pero cualquier nivel de expresión por encima de 500 fotones por segundo por cada célula se pueden visualizar con éxito en vivo. Ahora que tenemos las células de la actividad óptima, podemos pasar a la etapa de inyección subcutánea. Con el fin de facilitar la detección óptima del tumor, estamos utilizando una cepa atímicos inmunodeficientes ratón desnudo. Antes de la inyección, los animales son anestesiados para llevar a cabo para la anestesia profunda. A continuación vamos a inyectar hasta 250.000 células en 100 ul de PBS se inyectan por vía subcutánea en el flanco. La carga de las células en una jeringa de 1 ml y ponga una aguja de calibre 26. Levante la piel suavemente con unas pinzas para hacer una "tienda" e inyectar las células en la base. Las nuevas células inyectadas se pueden visualizar de inmediato. En cada sesión de imágenes de un total de 150 mg de luciferina por kg de peso luego se administra a través de dos inyecciones en la cavidad peritoneal. En este estudio, los animales son imágenes 10 minutos después de la inyección luciferina para asegurar el flujo de fotones coherentes. Le mostraremos esto en el próximo paso. Cinética de la luciferina puede variar de un día para otro. En este modelo en particular, la medición de 10 minutos después de la inyección luciferina dio un resultado dentro de un rango de 15% de la variabilidad. Para nuestro experimento vamos a utilizar el espectro IVIS en vivo sistema de imágenes utiliza un back-adelgazado dispositivo de carga acoplada refrigerados a -90 ° C para conseguir la máxima sensibilidad. Para apoyar la cuantificación absoluta, el sistema mide la carga oscura durante el tiempo de inactividad y ejecuta una auto-calibración durante la inicialización. Para empezar la imagen, inicializar el sistema IVIS (un clic) y establecer los parámetros de imagen para el experimento. Seleccione el campo de visión para el número de animales que se explora. Hasta 5 animales se pueden mantener en el instrumento a través del colector de anestésico integral. El escenario está en una constante de 37 ° C para mantener la temperatura corporal en los animales. Un puerto de ECG se proporciona para controlar la salud de los animales durante los procedimientos estresantes. Vivir en el software de imagen, tiempo de exposición, diafragmas y pixel binning se puede optimizar en función del nivel de expresión de la línea celular. Estos ajustes se pueden cambiar en cualquier momento durante un experimento sin afectar el resultado cuantitativo. IVIS adquiere una imagen fotográfica de los animales con luz blanca y una señal cuantitativa bioluminiscentes o fluorescentes, que se superpone en la imagen. La señal bioluminiscente se expresa en forma de fotones por segundo y se muestra como un mapa de intensidad. La visualización de la imagen se ajusta para proporcionar un contraste óptimo y la resolución de la imagen sin afectar a la cuantificación. Luminiscencia de las células se puede medir en el lugar de inyección con una región de la herramienta de interés. Los datos de medición se muestran en la tabla, junto con todos los parámetros experimentales relacionados con la captura de imágenes que se pueden guardar o exportar para su análisis Varias imágenes pueden ser adquiridas y comparados en los estudios longitudinales que cubren segundos o meses, dependiendo de la naturaleza del experimento. Vamos a medir el flujo de fotones del tumor en el momento cero y el monitor durante 4 semanas con imágenes a intervalos de dos semanas. Flujo de fotones del tumor es proporcional al número de células vivas que expresan luciferasa para la bioluminiscencia se correlaciona directamente con el tamaño del tumor. A los 5 días posteriores a la implantación del tumor no es aún palpable, pero las células pueden ser cuantificados a través de la bioluminiscencia y el tumor se ve que es de crecimiento activo. En esta etapa la señal de bioluminiscencia es mucho stronger. El tiempo de exposición, f-stop y pixel binning se puede ajustar para que la imagen es clara y la cámara no se sature. IVIS compensa automáticamente los cambios en la recolección de la luz así que estas medidas se puede comparar con los obtenidos antes y después del experimento. A los 7 días después del implante tumores son palpables, por primera vez y bioluminiscencia medida ya ha generado 7 días de datos. A los 28 días posteriores a la implantación, los tumores se están convirtiendo en necrosis y las células comienzan a morir. Estima que el tamaño del tumor mediante un calibre de medición no cambia apreciablemente, pero la luminiscencia del tumor se reducirá lo que indica la muerte celular. Mediciones de la pinza y la medición de bioluminiscencia se puede continuar hasta un punto final que se alcance humano. Necrosis del tumor debido a los regímenes de la hipoxia o el tratamiento será indicado por la bioluminiscencia reducido, incluso si no reducen la masa tumoral.