I artikeln beskrivs ett nytt protokoll och reagens som utformats för känslig mätning av neurotoxiska effekter av föreningar och behandlingar på co-kulturer av nervceller och astrocyter med högt innehåll analys. Resultaten visar att höga innehållsanalys är en spännande ny teknik för neurotoxicitet bedömning.
Hög halt Analys (HCA) analyser kombinera celler och reagenser detektion med automatiserad bildbehandling och kraftfull bild algoritmer analys, vilket gör att mätning av flera cellulära fenotyper inom en och samma analys. I denna studie utnyttjas vi HCA för att utveckla en ny analys för neurotoxicitet. Neurotoxicitet bedömning utgör en viktig del av drog säkerhetsbedömning, samt vara ett betydande fokus på miljöskydd insatser. Dessutom är neurotoxicitet också ett väl godkänt<em> In vitro</em> Markör för utveckling av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdomar. Nyligen har tillämpningen av HCA till neuronal screening rapporterats. Genom märkning neuronala celler med βIII-tubulin, kan HCA testmetoder ger hög genomströmning, icke-subjektiva, kvantitativa mätningar av parametrar såsom neuronala nummer, neurite räkna och neurite längd, som alla kan tyda neurotoxiska effekter. Dock fortfarande roll astrocyter outforskade i dessa modeller. Astrocyter har en viktig roll i upprätthållandet av centrala nervsystemet (CNS) homeostas och som är förknippade med både neuroprotektion och neurodegradation när de aktiveras som svar på giftiga ämnen eller stater sjukdom. GFAP är ett mellansteg glödtråd protein uttrycks huvudsakligen i astrocyter i CNS. Astrocytaktivering (gliosis) leder till uppreglering av GFAP, vanligen tillsammans med astrocyternas proliferation och hypertrofi. Denna process av reaktiva gliosis har föreslagits som en tidig markör för skador på nervsystemet. Den traditionella metoden för GFAP kvantifieringsmetoden är genom immunanalys. Denna metod är begränsad av en oförmåga att ge information om cellulär lokalisering, morfologi och mobilnummer. Vi bestämde att HCA kan användas för att övervinna dessa begränsningar och för att samtidigt mäta flera egenskaper som hör ihop med gliosis – förändringar i GFAP uttryck, astrocyternas hypertrofi och astrocyternas spridning – i en enda analys. I samarbete kultur studier har astrocyter visat sig skydda nervceller mot flera typer av giftiga förolämpning och att kritiskt påverka neuronal överlevnad. Nyligen genomförda studier har antytt att användning av astrocyter i en<em> In vitro</em> Neurotoxicitet testsystem kan vara mer relevant att människans CNS struktur och funktion än neuronala celler ensam. Därför har vi utvecklat en HCA-analys för samarbetet kultur av nervceller och astrocyter, som består av protokoll och validerats, målspecifik upptäckt reagenser för profilering βIII-tubulin och gliaceller fibrillära sura protein (GFAP). Denna analys möjliggör samtidig analys av neurotoxicitet, neurite utväxt, gliosis, neuronala och astrocytic morfologi och neuronala och astrocytic utveckling i en mängd olika cellulära modeller, som representerar en ny, icke-subjektiv, hög genomströmning assay för neurotoxicitet bedömning. Analysen har stor potential för ökad detektion av neurotoxicitet och förbättrad produktivitet inom neurovetenskap forskning och läkemedelsutveckling.
Hittills har in vitro-experiment för att studera bedömning neurotoxicitet risker med blandade kulturer av nervceller och astrocyter varit begränsad. Det är väl accepterat att gliaceller är integrerad i att tillhandahålla rumsliga och metabola stöd till nervceller, och spela en avgörande roll för modulerande flera neuronala funktioner, inklusive neuronala migration, differentiering och synaptisk aktivitet. Gliaceller astrocyter utsöndrar också cytokiner och andra lösliga faktorer som kan både inducera oönskade reaktioner i omgivande neuronal vävnad, samt främja neuronala tolerans för många gifter. Demonstration djupet av neuronala-gliaceller interaktioner, i samarbete kultur studier har astrocyter visat sig skydda nervceller mot toxiciteten av oxidativ stress, medan nedskrivningar av astrocytic funktioner, såsom underhåll av antioxidant försvar och cellulär energi nivåer, har visat sig kritiskt påverka neuronala överlevnad. Nyligen genomförda studier har antytt att användning av astrocyter i en in vitro neurotoxicitet test-systemet kan vara mer relevant för människors centrala nervsystemet struktur och funktion än neuronala celler ensam. Trots den ökande medvetenheten om den fysiologiska betydelsen av neuronala-astrocytic interaktioner har det varit tidigare svårt att utföra kvantitativa analyser av dessa interaktioner i intakta celler. Tillkomsten av Höga Content Screening möjliggör utvecklingen av nya kraftfulla analysmetoder för att lösa detta.
I denna studie har vi visat att kvantitativa analyser av flera neuronala och astrocytic fenotyper inom samma analys har gjorts möjligt genom HCA. I första hand nervceller har vi utfört kvantitativa mätningar av neurotoxicitet markörer som neuronala nummer, neurite räkna och neurite längd. I astrocyter, är reaktivt gliosis en känd biomarkör för neurotoxicitet, som kännetecknas av förändringar i GFAP uttryck, astrocyternas nummer och astrocyternas morfologi. Vi har visat att var och en av dessa effektmått lätt kan bedömas via HCA. Dessa studier stödjer uppfattningen att HCA av neural-specifika biomarkörer skulle kunna användas som en del av ett batteri av in vitro-tester för att snabbt skärm stort antal kemikalier för neurotoxiska slutpunkter.
Millipore är HCS222 Hög Content Analysis kit för samarbetet kultur av nervceller och astrocyter består av hög kvalitet upptäckt reagens och protokoll för samtidig profilering βIII-tubulin och gliaceller fibrillära sura protein (GFAP) i en mängd olika cellulära modeller av neurotoxicitet. Den högt validerade reagenser som medföljer denna sats tillåter användaren att standardisera analyser, minimera test-to-assay variation, och att reproducerbart generera bilder med en hög signal-bakgrund-förhållande.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till Matthew Hsu, Jehangir Mistry och Michele Hatler för support under utvecklingen av dessa projekt och protokoll.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
||
Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
||
Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
||
K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
||
DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
||
tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
HCS imaging/analysis system |