神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

細胞の準備： 増殖培地のアッセイは、培養ニューロン/アストロサイトのための細胞播種の前になるまで〜70-80％のコンフルエント（細胞が融解または分離から直接シードでない限り）。 目的の細胞の種類に適したメソッドを介して培養フラスコ/プレートから細胞を剥離する。必要に応じて、ポリ- D -リジン又は細胞外マトリックス蛋白質とコートのアッセイプレートのウェルに細胞接着を強化する。アストロサイトとニューロンの共培養は、同時または逐次にシードされる可能性があります。シーケンシャルseedingsの場合は、"基底"レイヤーとして最初のアストロサイトのメッキは、必要に応じて神経細胞のプレーティングと分化が続く、推奨されます。文化の時代、セルのソースおよび播種密度に応じて他のセルのタイプ、その後の培養時間、目的のパラメータ、に応じて細胞密度を調整し、初代培養は、増殖の速度、GFAPの発現や神経突起の伸長に大きく異なる場合があります – それは重要です特徴づけ、最適化して細胞のシステムをほとんどの生物学あなたの実験モデルの妥当性だけでなく、HCSを使用して効果的な画像処理、セグメンテーションと分析を提供するを提供する（図1参照）。プレート（細胞は以下のステップ3で説明したように毒素の治療を容易にするために、90μLメディアでシードされる可能性があります）にセルを追加した後、プレートをさらにcell配布を可能にする、15〜30分間室温温度でレベルの表面に座ってできます。増殖培地で、培養するには（37℃/ 5％CO 2）、分化の培養条件（例えば、PC12細胞の低血清/ NGF）に切り替えてから、少なくとも24時間はこの期間、必要に応じて、次の。細胞は細胞のタイプに適切な間隔でメディアを変更して、合流または分化の目的のレベルに達するまで培養を継続。 細胞治療は、（制御化合物、試験化合物、等）興味の治療の時間経過に応じて、この培養期間中の任意の時点で導入することができる。アクリルアミド、過酸化水素とK – 252Aは、神経毒性の制御化合物として提供されています。十分な試薬は、5つすべてを96ウェルプレート用の重複した12ポイントの用量反応曲線（用量反応内の一つのdH 2 OまたはDMSO -コントロールのセットを含む）のために用意されています。化合物は、250倍濃度（K – 252A用、1μMの最大の治療を想定）や10X（アクリルアミドおよび過酸化水素のため、それぞれ100 mMおよび10 mMの、最大の治療を想定）で提供されています。推奨される治療の準備には、ハーフログが含まれます：の化合物希釈緩衝液で希釈し、次いで（1√10）DMSO中の250X化合物の希釈系列を、10X（のdH 2 Oに起因10X制御化合物は、連続的滅菌のdH 2 Oで直接希釈してもよいまたは化合物の希釈バッファー）。各治療の10μLを、最終的な1X濃度（0.4％DMSOまたは10％のdH 2 O）のために、各ウェル内にすでに存在する培養培地90μLを加えてもよい。サンプルデータは、° C固定前に37℃で化合物の治療の24または96時間のために提供されています。 細胞の固定と免疫蛍光染色： 注：染色時間は約2.5時間後に固定です。井戸は、染色のステップ間を乾燥させないようにしてください。試薬の吸引と摂理は、流体の剪断に起因する任意のセルの損失を減少させるために低流量で実施されるべきである。すべての"ウェルあたりの推奨量は96ウェルマイクロプレートの1ウェルを参照してください。推奨されるすべての"当たり96 ​​ウェルプレート"のボリュームは、液体の取扱量の損失の25％の超過などがあります。すべての染色ステップは室温（RT）で実行されます。すべてのバッファと抗体溶液を室温で少なくとも24時間安定です。 培養期間の終了時に、室温（RT）または37℃に予熱するHCSの固定液（2X）（12 mL/96-wellプレート）必要に応じて。化学煙フードでは、直接培地に100μl/ウェルを追加し、室温で30分間固定することができます。 （MSDSを参照）固定/毒素含有培地を取り除き、有害廃棄物規制に準拠して処分する。染色にすぐに進む場合、HCS免疫緩衝液200μlで二回の各ウェルを洗う。また、プレートはあとで染色される場合は、洗浄緩衝液200μlで二回リンス、2番目のしっかりと染色されるまで4℃で密封井戸や店舗のプレートでボリュームをすすぎ残す。 固定試料は染色する前に、4℃で保存されている場合は、染色プロトコールに進む前に200μLHCS免疫緩衝液で2回すすいでください。 次のように、ウサギ抗βIIIチューブリン/マウス抗GFAP HCS一次抗体（6 mL/96-wellプレート）のワーキング溶液を調製します：HCS免疫バッファの5.88 mLにそれぞれ解凍した一次抗体60μLを追加する。よく混ぜる。以前の免疫蛍光バッファリンス取り外します。各ウェルに一次抗体溶液50μLを追加し、室温で1時間インキュベートします。 一次抗体を除去ソリューション。 200μLHCS免疫の緩衝液で3回リンス。 次のようHCS二次抗体/ヘキストHCS核染色（6 mL/96-wellプレート）のワーキング溶液を調製します：それぞれの融解二次抗体30μLと融解ヘキストHCS核の30μLHCS免疫バッファの5.91 mLにステインを追加する。光からソリューションを保護する、よく混ぜる。すすぎ前のHCS免疫バッファを削除します。 HCS二次抗体/ヘキストHCS核染色液の50μLを追加し、光から保護RT、で1時間インキュベートする。 HCS二次抗体/ヘキストHCS核染色溶液を除去。 200μLHCS免疫緩衝液で2回リンスします。 すすぎ前のHCS免疫バッファを削除します。井戸第二リンスボリュームを残し、HCSの洗浄バッファーを200μLで二回リンスします。 4℃ですぐにシールプレートおよび画像、またはストアのプレートは、イメージングのための準備が整うまで、光から保護。 画像の収集と解析： ステンドグラスプレートのイメージングと解析は、Cell AnalyzerのIN（GEヘルスケア）、ArrayScan（ThermoFisherサイエンティフィック）やオペラ（パーキンエルマー社）を含む、利用可能なHCSプラットフォーム、様々な時に実行されることがあります。イメージングと解析のためのいくつかのガイドラインを表1に提供されています。 HCS222画像集録ガイドライン 検出試薬 対物レンズ 励起フィルタ範囲[ピーク/帯域幅（nm）の] エミッションフィルターレンジ[ピーク/帯域幅（nm）の] ヘキストHCS核は​​染色 20X 40分の360 40分の460（または必要に応じて50分の535） HCS二次抗体、FITC -ロバ抗ウサギIgG 20X 40分の480 50分の535 HCS二次抗体、Cy3でロバ抗マウスIgG 20X 50分の535 50分の600 HCS222画像解析のガイドライン セルのパラメータ 検出 セグメンテーション/測定 論理的根拠 細胞数、核特性ヘキストHCS核は​​染色核領域（460nmの発光チャネル）。核の数をカウントします。 DNAの含有量（核強度）や核領域の解析も可能です。 セル損失、毒性の表現型、などが別々の神経細胞およびアストロサイトの細胞数/特性評価を得るためにβIII-チューブリンまたはGFAPの発現に関連するものを"フィルタ"核缶（強く推奨）を決定する細胞数、核特性を使用してください。 βIII-チューブリンの発現、神経突起伸長 HCS二次抗体、FITC結合細胞質領域（535 nmの発光チャネル）。 FITCのシグナルは、神経突起（ 例えば 、最小値/平均細胞体領域を介して、最大値/最小神経突起の長さと幅）から神経細胞体を区別するために使用されることがあります。このような全体の神経突起の長さは、神経突起カウント/セル、などなどのパラメータを決定する神経突起伸長の測定は、神経細胞分化の過程や化学傷害、疾患の状態、等の結果として変調された可能性があります異なる神経細胞の特性を（強く推奨）を取得するためにβIII-チューブリンの発現に関連するものを"フィルタ"細胞体できます。 GFAPの発現、アストロサイトエリア HCS二次抗体、Cy3結合細胞質領域（600 nm発光のチャネル）。 Cy3シグナルがアストロサイトの細胞質セグメンテーションを定義するために使用されることがあります。このような平均的な細胞質シグナル強度、セル面積、などのパラメータを決定する GFAPの発現と星状細胞の面積は、アストロサイトの開発中または化学的傷害、疾患の状態の結果として変調された可能性がある、などが明確な星状膠細胞の特性を（強く推奨）を取得するためにGFAP発現と関連するもののために細胞体を"フィルタリング"することができます。 表1画像取得と分析ガイドライン- HCS222βIII-Tubulin/GFAP（共培養）アッセイ代表的な結果： 図1。 βIII-チューブリン及びGFAP immunofluore混合ラットの神経細胞培養のscence。 PC12細胞は神経細胞の播種に続いて、培養中の数日間前めっきのアストロサイトによって生成された初代ラット海馬神経細胞またはラットのいずれかと初代ラット海馬アストロサイトの共培養。 PC12sが分化条件（低血清/ NGF）の下にさらに2日間培養しながら一次ニューロンは、追加の11日間培養した。セル処理、固定および免疫染色HCS222アッセイのプロトコールに従って実施した。細胞は20倍（一次ニューロン）や10X（PC12）客観的な倍率でセルアナライザー1000（3.3）でGE上に結像し、セルアナライザー1000ワークステーション（3.4）神経細胞とマルチターゲット分析のアルゴリズムではGEを用いて分析したトップパネルが。：ヘキストHCSステイン核（青）、βIII-チューブリン（緑）およびGFAP（赤）蛍光の融合画像。別βIII-チューブリンの蛍光チャネルの解析神経突起伸長のセグメンテーションを可能にする（ 中央のパネル：青（一次ニューロンに記載されている細胞体）や黄色（PC12）、緑（一次ニューロンの神経突起）や水色（PC12））。 GFAPのチャネルの分析は、アストロサイトセグメンテーション（：青、緑の細胞質に記載されている核下のパネル ）が可能になります。に別々のセルのカウントを可能にする、（赤） – （）ラット初代海馬ニューロン/アストロサイトの共培養のためのGFAPのセグメンテーションは、GFAP（+）（緑アウトライン）とGFAPされるものである核/細胞体を区別する能力を示しています混合培養設定のニューロンとアストロサイト。 図2。毒性ストレスに対するラット初代海馬ニューロン/アストロサイト共培養の用量が応答。 初代ラット海馬アストロサイトは、（P6）増殖培地で96ウェルプレートに播種し、6日間培養した。初代ラット海馬ニューロンを（解凍から直接）、事前メッキアストロサイトの上に播種し、11日間増殖培地で培養した。細胞は、培養の最後の24時間のアクリルアミドまたは過酸化水素（最大濃度= 100mMのと10mm、それぞれ）の連続希釈液で処理した。セル処理、固定および免疫染色HCS222アッセイのプロトコールに従って実施した。セルはセルアナライザー1000ワークステーション（3.4）神経細胞とマルチターゲット分析のアルゴリズムではGEを使用して（細胞質/核/神経突起セグメンテーション）20X（よく10フィールド/）でセルアナライザー1000（3.3）にGE上に結像し、分析した。提示されたデータは平均± SEM、n = 3のを。複数のパラメータを（神経突起伸長、GFAPの強度、アストロサイトの領域と神経やアストロサイトの細胞数）用量依存性の傾向を調べた。