Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi
Summary
Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.
Abstract
Yüksek İçerik Analizi (HCA) testleri tek bir tahlil içinde birden çok hücre fenotipleri ölçümü sağlayan hücreleri ve algılama reaktifleri otomatik görüntüleme ve güçlü görüntü analizi algoritmaları ile birleştirir. Bu çalışmada, nörotoksisite için yeni bir tahlil geliştirmek için HCA kullandı. Nörotoksisite değerlendirme, önemli bir ilaç güvenliği değerlendirmesi bir parçası olarak, çevre koruma çabalarının önemli bir odak olmanın yanı sıra temsil eder. Ayrıca, nörotoksisite de iyi kabul edilir<em> In vitro</emAlzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların gelişimi> belirteç. Son zamanlarda, HCA nöronal tarama uygulaması bildirilmiştir. ΒIII-tubulin nöronal hücrelerin etiketleme, HCA deneyleri nöron sayısı, neurite sayısı ve neurite uzunluğu, nörotoksik etkileri olduğunu göstermemektedir bütün bunlar gibi parametrelerin yüksek verimli olmayan öznel, nicel ölçümleri sağlayabilir. Ancak, astrositler rolü bu modellerin keşfedilmemiş kalır. Astrositler, merkezi sinir sistemi (MSS) homeostazının bakım tamamlayıcı bir rol var ve bunlar toksik maddeler veya hastalık durumlarında tepki aktive nöro ve neurodegradation ile ilişkilidir. GFAP CNS astrositler ağırlıklı olarak ifade bir ara filament proteindir. Astrositik aktivasyonu (gliozis) yaygın astrosit proliferasyon ve hipertrofi eşlik GFAP upregülasyonunun yol açar. Reaktif gliozis Bu işlem, sinir sistemi hasarı erken belirteci olarak öne sürülmüştür. Immunoassay ile GFAP kantitatif için geleneksel yöntem. Bu yaklaşım, hücresel lokalizasyonu, morfolojisi ve hücre sayısı hakkında bilgi sağlamak için bir yetersizlik ile sınırlıdır. Biz HCA bu sınırlamaları aşmak için, ve aynı anda birden çok özellik gliozis ile ilişkili ölçmek için kullanılan olabilir tespit GFAP ifade değişiklikleri, astrosit hipertrofisi ve astrosit proliferasyonu – tek bir tahlil içinde. Ko-kültür çalışmaları, astrositler nöronlar çeşitli toksik hakaret karşı korumak ve eleştirel nöronal hayatta kalma etkisi görülmüştür. Son çalışmalar önerilen olduğunu bir astrositler kullanımı<em> In vitro</em> Nörotoksisite test sistemi sadece nöronal hücrelerin daha insan MSS yapısı ve fonksiyonu için daha uygun ispat edebilir. ΒIII-tubulin ve glial fibriller asidik protein (GFAP) profil Dolayısıyla, biz, bir HCA testi astrositler nöronlar ve ortak kültürü için geliştirilen protokolleri oluşan ve valide, hedef özel algılama reaktifleri. Bu testte, nörotoksisite değerlendirmesi olmayan öznel, yüksek verimli test bir roman temsil nörotoksisite aynı anda analiz, neurite akıbet, gliozis, cep modelleri çok çeşitli nöronal ve astrositik morfoloji ve nöronal ve astrositik gelişim sağlar. Testi, nörolojik araştırma ve ilaç keşfi nörotoksisite ve geliştirilmiş verimlilik gelişmiş algılama için büyük bir potansiyele sahiptir.
Protocol
Discussion
Bugüne kadar astrositler nöronlar ve karışık kültürlerin kullanıldığı nörotoksisite risk değerlendirme çalışması için tasarlanmış, in vitro deneyler sınırlı kalmıştır. Glial hücreleri nöronlar için mekansal ve metabolik destek sağlayan ayrılmaz bir parçasıdır ve nöronal göç, farklılaşma ve sinaptik aktivite de dahil olmak üzere modüle birçok nöronal fonksiyonları, kritik bir rol oynadığı iyi kabul edilir. Glial astrositler birçok toksinler de nöronal doku çevresindeki olumsuz tepkiler inducing yanı sıra teşvik nöronal hoşgörü yeteneğine sahiptir sitokinler ve diğer çözünür faktörlerin de bırakın. Antioksidan savunma bakım ve hücresel enerji düzeyleri gibi astrositik fonksiyonları, değer düşüklüğü görülmüştür ise nöronal-glial etkileşimleri derinliği gösterilmesi, ko-kültür çalışmaları, astrositler nöronlar oksidatif stres toksisite karşı korumak için gösterilen edilmiştir eleştirel nöronal hayatta kalma etkiler. Son çalışmalar, in vitro nörotoksisite test sistemi bir astrositler kullanımı tek başına nöronal hücrelerin daha insan merkezi sinir sisteminin yapısı ve fonksiyonu için daha uygun ispat edebilir ileri sürmüşlerdir. Nöronal astrositik etkileşimleri fizyolojik önemi artan farkındalık rağmen, daha önce sağlam hücreleri bu etkileşimlerin kantitatif analizleri gerçekleştirmek için zor olmuştur. Yüksek İçerik Tarama gelişiyle yeni ve güçlü testlerinin geliştirilmesi bu adrese sağlar.
Bu çalışmada, kantitatif analizleri tek bir tahlil içinde birden çok nöronal ve astrositik fenotipleri HCA ile mümkün olduğunu göstermiştir. Primer nöronlar, nöron sayısı, neurite sayısı ve neurite uzunluk olarak nörotoksisite belirteçlerin kantitatif ölçümler gerçekleştirdik. Astrositler, reaktif gliozis nörotoksisite bilinen bir biyomarker, GFAP ifade astrosit numarası ve astrosit morfolojisi değişiklikler ile karakterizedir. Biz bu uç noktalarının her biri kolay HCA ile değerlendirilebilir göstermiştir. Bu çalışmalar, sinir-özgü biyobelirteçlerin HCA nörotoksik uç noktaları kimyasalların hızla çok sayıda ekrana in vitro testler bir pil parçası olarak kullanılan olabilir bu kavramı destekler .
Millipore astrositler nöronlar ve ortak kültür HCS222 Yüksek İçerik Analizi kiti yüksek kaliteli algılama reaktifler ve aynı anda nörotoksisite cep telefonu modelleri çok çeşitli βIII-tubulin ve glial fibriller asidik protein (GFAP) profil için protokolleri oluşur. Bu kit ile sağlanan yüksek geçerliliği reaktifler kullanıcı testleri standardize tahlil-tahlil değişkenliği en aza indirmek ve tekrarlanabilir yüksek bir sinyal-zemin oranı ile görüntü oluşturmak için izin verir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till Matthew Hsu, Jehangir Mistry ve bu projeler ve protokoller geliştirilmesi sırasında destek Michele Hatler.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
||
| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
||
| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
||
| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
||
| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
| HCS imaging/analysis system |
References
- Radio, N. M., Mundy, W. R. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).
- Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
- Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).
- Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
- Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
- Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
- Prockop, L. D. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
- Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).
- Holden, L. J., Coleman, M. D. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241, 75-83 (2007).
- Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
- Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
- Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
- O’Callaghan, J. P., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
- Mead, C., Pentreath, V. W. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?. Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
- Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).
- Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
- Weible, M. W., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
- Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
- Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
- Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).
