עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.
Abstract
גבוהה ניתוח תוכן (HCA) מבחני לשלב תאים ריאגנטים זיהוי עם הדמיה אוטומטיות עוצמה לניתוח אלגוריתמים תמונה, המאפשר מדידה של פנוטיפים הסלולר מרובים בתוך assay אחד. במחקר הנוכחי, השתמשנו HCA לפתח assay הרומן neurotoxicity. Neurotoxicity הערכה מהווה חלק חשוב של הערכה בטיחות התרופה, כמו גם להיות מוקד משמעותי של מאמצי הגנת הסביבה. בנוסף, neurotoxicity גם היטב קיבל<em> במבחנה</em> סמן להתפתחות מחלות ניווניות כגון אלצהיימר ופרקינסון. לאחרונה, היישום של HCA להקרנה עצבית דווחה. על ידי סימון תאים עצביים עם טובולין-βIII, מבחני HCA יכול לספק תפוקה גבוהה, לא סובייקטיבית, מדידות כמותית של פרמטרים כגון מספר העצבית, לספור neurite ואורך neurite, כל אשר יכול להצביע על ההשפעות הנוירו. עם זאת, התפקיד של האסטרוציטים נשאר נחקרו במודלים אלה. האסטרוציטים יש תפקיד אינטגרלי בשמירה על איזון מערכת העצבים המרכזית (CNS), והן קשורות עם neuroprotection והן neurodegradation כאשר הם מופעלים בתגובה חומרים רעילים או מצבי מחלה. GFAP הוא חלבון נימה ביניים הביעו בעיקר האסטרוציטים של מערכת העצבים המרכזית. הפעלת Astrocytic (דבקת) מוביל upregulation של GFAP, מלווה בדרך כלל על ידי הפצת היפרטרופיה astrocyte ו. תהליך זה של דבקת תגובתי הוצע כסמן מוקדם של נזק למערכת העצבים. השיטה המסורתית quantitation GFAP היא immunoassay. גישה זו היא מוגבלת על ידי חוסר יכולת לספק מידע על לוקליזציה מורפולוגיה הסלולר, ומספר התא. אנו נקבע כי HCA יכול לשמש כדי להתגבר על המגבלות האלה ואת למדוד בו זמנית מספר רב של תכונות הקשורות דבקת – שינויים בביטוי GFAP, היפרטרופיה astrocyte, ושגשוגם astrocyte – בתוך assay אחד. בשנת שיתוף תרבות מחקרים, האסטרוציטים הוכחו להגן על הנוירונים מפני מספר סוגים של עלבון רעילים כדי להשפיע באופן קריטי להישרדות עצביים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השימוש האסטרוציטים ב<em> במבחנה</em> מבחן מערכת neurotoxicity עשוי להוכיח רלוונטיות יותר מבנה מערכת העצבים המרכזית לתפקד האדם מאשר תאים עצביים לבד. בהתאם לכך, פיתחנו assay HCA לתרבות משותפת של נוירונים האסטרוציטים, המורכב פרוטוקולים תוקף, יעד ספציפי ריאגנטים עבור זיהוי פרופיל βIII-טובולין וחלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). Assay זה מאפשר ניתוח סימולטני של neurotoxicity, תולדה neurite, דבקת, מורפולוגיה עצב astrocytic ופיתוח עצב astrocytic במגוון רחב של דגמים סלולריים, המייצג את רומן, לא סובייקטיבית, תפוקה גבוהה assay להערכה neurotoxicity. Assay מחזיקה פוטנציאל גדול לאיתור משופרת של neurotoxicity פרודוקטיביות משופרת במדעי המוח מחקר גילוי תרופות.
Protocol
Discussion
עד כה, בניסויים במבחנה נועד המחקר הסיכון neurotoxicity הערכה באמצעות תרביות מעורבות של נוירונים האסטרוציטים היה מוגבל. זה היטב מקובל כי תאי גלייה הם חלק בלתי נפרד במתן תמיכה מרחבית מטבולית לנוירונים, לשחק תפקיד קריטי ויסות עצבי פונקציות שונות, כולל הגירה בידול עצבית, פעילות סינפטית. האסטרוציטים גליה גם לשחרר ציטוקינים וגורמים מסיסים אחרים המסוגלים סובלנות הן עצבי וגורם לתגובות שליליות לרקמות העצבית, כמו גם קידום של רעלים רבים. הדגמת העומק של נוירונים, גליה אינטראקציות, ב שיתוף תרבות מחקרים, האסטרוציטים הוכחו כדי להגן על הנוירונים מפני רעילות של סטרס חמצוני, ואילו ליקוי astrocytic של פונקציות, כגון החזקת ההגנה נוגדת החמצון ורמות האנרגיה התאית, הוכח השפעה קריטית להישרדות עצביים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השימוש האסטרוציטים ב במערכת בדיקה חוץ גופית neurotoxicity עשוי להוכיח רלוונטיות יותר במבנה מערכת העצבים המרכזית האדם ותפקודו מאשר תאים עצביים לבד. למרות המודעות ההולכת וגדלה של המשמעות הפיזיולוגית של הנוירונים-astrocytic אינטראקציות, זה כבר קודם לכן קשה לבצע ניתוחים כמותיים של אינטראקציות אלה בתאים שלמים. הופעתו של הקרנת תכנים גבוהה מאפשרת את הפיתוח של מבחני חדש רב עוצמה לכתובת זו.
במחקר זה, אנו הראו כי ניתוחים כמותיים של פנוטיפים עצב astrocytic מרובים בתוך assay יחיד מתאפשרים הודות HCA. בנוירונים העיקרי לנו לבצע מדידות כמותיות של סמנים neurotoxicity כגון מספר העצבית, לספור neurite ואורך neurite. ב האסטרוציטים, דבקת תגובתי היא סמן ביולוגי ידוע neurotoxicity, מאופיין על ידי שינויים בביטוי GFAP, מספר astrocyte ומורפולוגיה astrocyte. אנחנו הוכיחו כי כל נקודות הקצה אלה עשויים בקלות להעריך באמצעות HCA. מחקרים אלה תומכים מושג HCA של עצבי ספציפי סמנים ביולוגיים יכול לשמש כחלק סוללה של בדיקות in vitro במהירות המסך מספר רב של כימיקלים עבור נקודות קצה neurotoxic.
HCS222 ניתוח גבוהה של Millipore תוכן הערכה לתרבות משותפת של נוירונים האסטרוציטים מורכבת באיכות גבוהה ריאגנטים איתור פרוטוקולים בו זמנית פרופיל βIII-טובולין ו – גליה חלבון fibrillary חומצי (GFAP) במגוון רחב של דגמים סלולריים של neurotoxicity. הפערים תוקף ריאגנטים מסופק עם ערכה זו מאפשרת למשתמש לבצע סטנדרטיזציה של מבחני, למזער assay-to-assay השתנות, וכן reproducibly להפיק תמונות עם יחס אות רקע גבוה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות בני הזוג. ריק ריאן, ואומש פאטל, ג'ף עד, מתיו הסו, ג'האנגיר מיסטרי ומישל Hatler על התמיכה במהלך הפיתוח של הפרויקטים הללו ופרוטוקולים.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
||
| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
||
| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
||
| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
||
| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
| HCS imaging/analysis system |
References
- Radio, N. M., Mundy, W. R. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).
- Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
- Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).
- Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
- Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
- Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
- Prockop, L. D. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
- Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).
- Holden, L. J., Coleman, M. D. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241, 75-83 (2007).
- Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
- Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
- Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
- O’Callaghan, J. P., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
- Mead, C., Pentreath, V. W. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?. Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
- Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).
- Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
- Weible, M. W., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
- Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
- Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
- Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).
