Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Introdução ao Equipamento Tecido é cuidadosamente dissociada, utilizando tubos de violeta C em uma única célula viável suspensões. O PBS / BSA-tampão de EDTA é utilizado para dissociar as células. O buffer é preparada por adição de 1 parte de solução de BSA estoque para 20 partes de autoMACS lavagem solução contendo EDTA. O MACS pré-separação Filtros são usados ​​para que as amostras de tecido dissociado estão livres de todos os aglomerados de células, promovendo a separação MACS sucesso e posterior análise. Dissociar as células do baço Baços todo são disscociated em uma única célula suspensões de esplenócitos usando o Dissociator gentleMACS. Para iniciar o procedimento, coloque o tubo C com um volume de tampão de acordo com a massa do baço. Um baço saudável de um jovem adulto camundongo BALB / c fêmeas pesa cerca de 80-120 mg. Cada 1 a 2 baços dessa massa necessitam de 3 mL de tampão. Baços de animais mais velhos ou animais com infecções são muitas vezes maiores e devem ser pesados ​​em buffer. Os volumes de buffer deve ser adaptado em conformidade. Não exceder o volume total do buffer de 10 mL. Adicione o baço dissecados para o tubo C contendo 3 ml de tampão. Certifique-se de que a tampa do tubo C é apertado e conecte o tubo C ao dissociator com a tampa para baixo. Ligue o dissociator. Por 1-2 baços, selecione m_spleen_01 programa. O programa terá 56 segundo para ser concluído. Se o número de baços é maior, usar o programa m_spleen_04; este programa pode ser usado para até 720 mg de tecido esplênico. Após a conclusão do programa, o tecido do baço nativa é dissociada em uma suspensão esplenócitos. Girar a suspensão de células inteiras em 300xg em temperatura ambiente por cerca de 30 seg. Isso irá garantir que o rotor eo estator são libertados de todas as células que são coletados na parte inferior do tubo C. Retirar a amostra através do septo, selada abertura da tampa do tubo C usando uma pipeta 1000 microlitro. Etapa de filtração Para começar a etapa de filtração, aplicar o tecido dissociado para o Filtro de pré-separação ou um filtro de células com 30 mM tamanho dos poros. O filtro deve caber um tubo de 15 mL por 1-2 baços ou um tubo de 50 mL por mais de 2 baços. Deixe a suspensão de células passar. Em seguida, lave o filtro através da aplicação de 5 mL de tampão. Agora, centrifugar o tubo com a suspensão de células em 300xg, em temperatura ambiente por 10 minutos para coletar todos os esplenócitos em um baço pellet celular. Agora, que temos uma pelota de esplenócitos dissociados, devemos aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em uma quantidade adequada de buffer. Dissociação baço usando o Dissociator gentleMACS renderá uma elevada percentagem de esplenócitos viável, o que é demonstrado por citometria de fluxo usando o Analisador MACSQuant. Células mortas estão manchadas pelo iodeto de propídio. No exemplo fornecido, o atacante lado gráfico de pontos de dispersão mostra o esplenócitos preparado.