Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

Einführung in die Geräte Das Gewebe wird sanft dissoziiert, mit violetten C Tubes zu tragfähigen Einzel-Zell-Suspensionen. Die PBS / BSA EDTA-Puffer wird verwendet, um die Zellen zu distanzieren. Der Puffer wird durch Zugabe von 1 Teil BSA Stammlösung auf 20 Teile autoMACS Spüllösung EDTA vorbereitet. Das MACS Pre-Separation Filter sind so, dass die dissoziierten Gewebeproben frei von allen Zellklumpen verwendet werden, die Förderung der erfolgreichen MACS Trennung und anschließender Analyse. Dissoziation der Milzzellen Whole Milz werden in Einzel-Zellsuspensionen von Splenozyten mit dem gentleMACS Dissociator disscociated. Zu Beginn des Verfahrens, laden Sie die C Tube mit einem Volumen von Puffer nach der Masse der Milz. Eine gesunde Milz eines jungen erwachsenen weiblichen BALB / c Maus wiegt etwa 80-120 mg. Jeder von 1 bis 2 Milzen dieser Masse benötigen 3 ml Puffer. Milz von älteren Tieren oder Tieren mit Infektionen sind oft größer und muss in Puffer abgewogen werden. Der Puffer Volumina müssen entsprechend skaliert werden. Nicht mehr als insgesamt Puffer Volumen von 10 mL. Fügen Sie die Milz seziert, um die C Tube enthält 3 ml Puffer. Stellen Sie sicher, dass die C Tubenkappe dicht ist und bringen Sie die C Rohr zur dissociator der Sockel nach unten. Schalten Sie den dissociator. Für 1-2 Milz, wählen Sie Programm m_spleen_01. Das Programm dauert 56 Sekunden dauern. Wenn die Anzahl der Milz ist größer, benutzerfreundliches Programm m_spleen_04; dieses Programm kann verwendet werden für bis zu 720 mg Milzgewebe. Nach Abschluss des Programms der einheimischen Milzgewebe wird in eine Splenozyten Federung dissoziiert. Spin, den ganzen Zellsuspension bei 300xg bei Raumtemperatur für etwa 30 Sekunden. Dadurch wird sichergestellt, dass der Rotor und Stator aller Zellen, die an der Unterseite der C Rohr gesammelt werden, werden freigegeben. Entfernen Sie die Probe durch das Septum verschlossenen Öffnung in der C Tubenkappe mit einem 1000 Mikroliter Pipette. Filtrationsschritt Zu Beginn der Filtration, gelten die dissoziierten Gewebe um die Pre-Separation Filter oder eine Zelle Sieb mit 30 um Porengröße. Das Sieb sollte ein 15-ml-Tube für 1-2 Milz oder ein 50-ml-Tube fit für mehr als 2 Milz. Lassen Sie die Zellsuspension durch. Dann waschen Sie den Filter, indem 5 ml Puffer. Nun Zentrifuge das Rohr mit der Zellsuspension bei 300xg, bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um alle Splenozyten in der Milz Zellpellet zu sammeln. Nun, dass wir ein Pellet aus dissoziierten Milzzellen haben, müssen wir saugen den Überstand und Zellpellet in einer entsprechenden Menge an Puffer. Spleen Dissoziation mit dem gentleMACS Dissociator wird ein hoher Anteil von lebensfähigen Splenozyten, die mittels Durchflusszytometrie mit dem MACSQuant Analyzer demonstriert wird. Tote Zellen werden durch Propidiumiodid gefärbt. In dem Beispiel vorgesehen, zeigt die Vorderseite streuen Dot-Plot die vorbereitete Splenozyten.