إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

مقدمة لمعدات فصل الأنسجة بلطف ، وذلك باستخدام أنابيب البنفسج C إلى تعليق وحيد الخلية قادرة على البقاء. يستخدم EDTA العازلة PBS / جيش صرب البوسنة لفصل الخلايا. مستعدة العازلة إضافة 1 جزء من الحل للسهم BSA إلى 20 أجزاء من autoMACS الشطف محلول يحتوي على EDTA. وتستخدم في فصل تمهيدي MACS مرشحات بحيث ينفصل عينات الأنسجة خالية من جميع كتل الخلية ، وتعزيز نجاح MACS الانفصال وتحليل لاحقة. عدم الربط بين خلايا الطحال والطحال disscociated كله الى وحيد الخلية من معلقات splenocytes باستخدام Dissociator gentleMACS. للبدء في الإجراءات ، تحميل أنبوب C مع حجم المخزن المؤقت وفقا لكتلة الطحال. والطحال السليم للماوس الكبار BALB / ج الشابات يزن حوالي 80-120 ملغ. كل الطحال 1 إلى 2 من هذه الكتلة يتطلب 3 مل من العازلة. الطحال من الحيوانات القديمة أو الحيوانات مع الالتهابات غالبا ما تكون أكبر ويجب أن يوزن العازلة. ويجب توسيع وحدات التخزين العازلة وفقا لذلك. لا يتجاوز حجم المخزن ما مجموعه 10 مل. تشريح الطحال إضافة إلى أنبوب C تحتوي على 3 مل من العازلة. تأكد من أن غطاء الأنبوبة C ضيق ونعلق أنبوب جيم للdissociator مع الغطاء لأسفل. السلطة حتى dissociator. لمدة 1-2 الطحال ، حدد m_spleen_01 البرنامج. البرنامج سوف يستغرق 56 ثانية لإكمال. إذا كان عدد الطحال هو أكبر ، واستخدام برنامج m_spleen_04 ، ويمكن استخدام هذا البرنامج لمدة تصل إلى 720 ملغ من نسيج الطحال. بعد الانتهاء من برنامج نسيج الطحال الأم هي نأت الى تعليق خلية طحالية. تدور باستمرار تعليق خلية كاملة في 300xg في درجة حرارة الغرفة لمدة حوالي 30 ثانية. وهذا ضمان الافراج عن الدوار والجزء الثابت من كافة الخلايا التي يتم جمعها في الجزء السفلي من أنبوب C. إزالة عينة عن طريق فتح الحاجز مختومة في سقف الأنبوبة باستخدام C pipetter ميكروليتر 1000. خطوة الترشيح بدء الخطوة الترشيح ، وتطبيق فصل الأنسجة إلى تصفية ما قبل الانفصال أو مصفاة مع حجم الخلية 30 ميكرومتر المسام. يجب أن تتناسب مع أنبوب مصفاة 15 مليلتر لمدة 1-2 الطحال أو أنبوب 50 مل لأكثر من 2 الطحال. ترك التعليق الخلية بالمرور. ثم يغسل التصفية من خلال تطبيق 5 مل من العازلة. الآن ، وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب مع تعليق خلية في 300xg ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لجمع كل splenocytes في الطحال بيليه الخلية. الآن ، ان لدينا من بيليه splenocytes فصلها ، يجب علينا أن نضح في وطاف بيليه resuspend في خلية في مبلغ مناسب للالعازلة. سوف تفارق الطحال باستخدام Dissociator gentleMACS العائد على نسبة عالية من splenocytes قابلة للحياة ، وهو ما يتضح من التدفق الخلوي باستخدام محلل MACSQuant. هي ملطخة الخلايا الميتة التي يوديد propidium. في المثال المقدمة ، مبعثر الجانب قدما مؤامرة نقطة يبين splenocytes المعدة.