Encyclopedia of Experiments: Biology
É necessário ter uma assinatura JoVE para assistir este Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Para avaliar a locomoção em C. elegans, use uma câmera para registrar o movimento dos vermes em uma placa de ágar, garantindo até mesmo a iluminação da placa durante a gravação.
Coloque vários anéis de cobre em uma placa para rastrear simultaneamente vermes em cada anel. Isso permite que a avaliação do controle e animais experimentais sejam realizados em condições idênticas, reduzindo a variabilidade do dia a dia e permitindo comparações lado a lado. Registo o movimento dos vermes ao longo dos intervalos de tempo definidos e use o software de computador para analisar características do comportamento da locomotiva, como a velocidade de movimento e a distância percorrida.
No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração de um ensaio de rastreamento de movimento testando os efeitos do álcool na velocidade de locomoção do verme.
- Para começar, leve dois minutos ou menos para transferir 10 vermes de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre em uma placa de aclimatação. Esta é uma placa sem etanol. Evite transferir alimentos com os vermes, pois reduzirá seu movimento. Também evite danificar a superfície do ágar porque os vermes vão cavar. Registre o tempo de carregamento na placa, e certifique-se de escalonar a transferência de vermes para cada placa por mais de dois minutos, para que cada placa possa ser filmada individualmente no intervalo de tempo apropriado.
Deixe cada placa de aclimatação incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, transfira os vermes para a placa de ensaio, seguindo a ordem usada para colocar os vermes na placa de aclimatação. Usando uma picareta de verme achatado sem bactérias, colete os vermes em cima da picareta achatada usando um movimento de colher.
- A velocidade com que os animais são transferidos nesta etapa é muito importante, pois os animais transferidos ficarão expostos ao etanol por mais tempo. Por isso é uma boa ideia girar quais cepas são colocadas na placa primeiro através de réplicas experimentais.
- Um microscópio com câmera de vídeo de alta resolução é necessário para filmar os vermes agora. Mesmo a iluminação, como a partir de uma luz de fundo quadrada de três polegadas, é vital para a análise.
Prepare o software de análise de imagem para capturar filmes de análise de 120 quadros, 12 bits, escala de cinza e lapso de tempo em um quadro por segundo. Para reduzir o tamanho do arquivo de saída, mantendo ainda a resolução de imagem suficiente, use um modo binning de dois por dois.
Agora grave filmes de dois minutos de cada placa, 10 minutos após os últimos worms serem colocados nessa placa. Em seguida, faça uma segunda gravação de dois minutos, 30 minutos depois que os worms foram colocados na placa. Para esta demonstração o software Image-Pro Plus é usado, pois uma grande variedade de outros softwares podem ser adaptados à técnica.
Primeiro aplique um filtro às imagens que achata o plano de fundo e melhore o contraste dos objetos worm. No menu, selecione Processar, depois Filtros, depois Aprimoramento e, em seguida, Achate. Defina o parâmetro para um fundo escuro e uma largura de recurso de 20 Pix.
Agora, analise a locomoção dos animais em cada anel separadamente com uma região circular de interesse que se sobrepõe ao anel de cobre. Identifique e rastreie os worms com o comando Track Objects sob o subempático Measure.
Na janela Tabela de dados de rastreamento, use o botão Opções de rastreamento para permitir que faixas específicas sejam excluídas e para limitar quaisquer artefatos experimentais. Sob a guia Rastreamento automático, defina os parâmetros de faixa para um limite de velocidade de 400 mícrons por quadro. Defina o limite de aceleração para automático.
Defina o comprimento mínimo total da faixa para 400 mícrons e defina o Tipo de Movimento Predominante para caótico. Em seguida, sob o parâmetro de faixa, defina os objetos para permitir que faixas parciais tenham um comprimento mínimo de 21 quadros e tenham uma profundidade de projeção de rastreamento de um quadro.
Agora, para iniciar o processo de rastreamento, clique primeiro no botão Localizar todas as faixas automaticamente funciona. Isso traz a caixa de diálogo Contagem/Opções de Tamanho e a caixa de Diálogo de Rastreamento. Selecione a opção Manual para a Seleção de Faixa de Intensidade na caixa Contagem/Tamanho. Isso fornece uma etapa importante do limiar. Em seguida, ajusta os controles deslizantes limiar de intensidade para criar uma faixa inclusiva que destaca objetos escuros.
Agora aplique um filtro de tamanho para excluir objetos maiores ou menores que um único worm. Vá para o menu Medir e, em seguida, selecione Medição sub menu. Isso abre a caixa de diálogo de opções Contagem/Tamanho. Lá, defina a faixa de área para 28.000 a 120.000 mícrons quadrados.
Agora, complete o processo de rastreamento clicando em Continuar na caixa de diálogo de rastreamento. Verifique duas vezes se a saída acompanha com as imagens do filme. Certifique-se de que cada worm seja representado a menos que haja uma razão clara para filtrar.
Em seguida, calcule a velocidade de cada verme, com uma média da distância percorrida entre cada quadro ou cada segundo, e crie uma velocidade média para as faixas em cada população. Considere esta média final como um ponto amostral para análise estatística do experimento.
