Questo studio introduce un nuovo bagno di sospensione sub-microgel di κ-carragenina, che mostra notevoli proprietà di transizione reversibile di inceppamento-sbloccaggio. Questi attributi contribuiscono alla costruzione di tessuti e organi biomimetici nel bioprinting 3D incorporato. La stampa di successo di tessuti simili al cuore/all’esofago con alta risoluzione e crescita cellulare dimostra applicazioni di bioprinting e ingegneria tissutale di alta qualità.
La biostampa tridimensionale (3D) incorporata che utilizza un bagno di supporto in idrogel granulare è emersa come una tecnica fondamentale per la creazione di scaffold biomimetici. Tuttavia, l’ingegnerizzazione di un mezzo di sospensione in gel adatto che bilanci la precisa deposizione di bioink con la vitalità e la funzione cellulare presenta molteplici sfide, in particolare per ottenere le proprietà viscoelastiche desiderate. Qui, un nuovo bagno di supporto in gel di κ-carragenina viene fabbricato attraverso un processo di macinazione meccanica facile da usare, producendo particelle omogenee su scala sub-micrometrica. Questi sub-microgel mostrano il tipico comportamento del flusso di Bingham con un piccolo stress di snervamento e proprietà di assottigliamento rapido del taglio, che facilitano la deposizione regolare dei bioink. Inoltre, la transizione reversibile gel-sol e le capacità di autoguarigione della rete di microgel κ-carragenina garantiscono l’integrità strutturale dei costrutti stampati, consentendo la creazione di strutture tissutali complesse e multistrato con caratteristiche architettoniche definite. Dopo la stampa, i sub-microgel di κ-carragenina possono essere facilmente rimossi con un semplice lavaggio salino tamponato con fosfato. Un’ulteriore biostampa con bioink carichi di cellule dimostra che le cellule all’interno dei costrutti biomimetici hanno un’elevata vitalità del 92% e si estendono rapidamente agli pseudopodi, oltre a mantenere una robusta proliferazione, indicando il potenziale di questa strategia di bioprinting per la fabbricazione di tessuti e organi. In sintesi, questo nuovo sub-microgel di κ-carragenina emerge come una strada promettente per la biostampa incorporata di qualità eccezionale, con profonde implicazioni per lo sviluppo in vitro di tessuti e organi ingegnerizzati.
Gli scaffold di ingegneria tissutale, tra cui fibre elettrofilate, spugne porose e idrogel polimerici, svolgono un ruolo fondamentale nella riparazione e ricostruzione di tessuti e organi danneggiati, fornendo una struttura strutturale che supporta la crescita cellulare, la rigenerazione dei tessuti e il ripristino della funzione degli organi 1,2,3. Tuttavia, gli scaffold tradizionali incontrano sfide nel replicare accuratamente le strutture tissutali native, portando a una discrepanza tra i tessuti ingegnerizzati e quelli naturali. Questa limitazione ostacola l’efficiente guarigione dei tessuti difettosi, sottolineando l’urgente necessità di progressi nella progettazione di scaffold per ottenere una biomimetica più accurata. Il bioprinting tridimensionale (3D) è una tecnica di produzione innovativa che costruisce con precisione strutture di tessuti biologici complessi strato per strato utilizzando inchiostri e cellule di biomateriali4. Tra i vari biomateriali, gli idrogel polimerici emergono come bioink ideali con la loro rete distintiva che facilita l’incapsulamento in situ delle cellule e ne supporta in modo crucialela crescita 5,6. Tuttavia, molti idrogel morbidi e altamente idratati tendono a indurre sfocatura o rapido collasso delle strutture di scaffold stampate durante il processo di stampa quando vengono utilizzati come bioink. Per affrontare questa sfida, la tecnologia di bioprinting 3D incorporata impiega un bagno di microgel come materiale di supporto, consentendo una precisa deposizione di bioink morbido. Dopo la gelificazione dei bioink idrogel, rimuovendo il bagno di microgel si ottengono raffinati scaffold bionici con strutture intricate. Materiali come la gelatina 7,8, l’agarosio9 e la gomma di gellano10,11 sono stati impiegati per creare bagni di microgel per la biostampa 3D incorporata, facendo progredire in modo significativo l’applicazione di idrogel morbidi nell’ingegneria tissutale. Tuttavia, la dimensione delle particelle a livello di micron e non uniforme di questi gel di particolato influisce negativamente sulla risoluzione e sulla fedeltà della stampa 3D 12,13,14. C’è un urgente bisogno di fabbricare un galleggiante di sospensione simile al gel con particelle piccole e uniformemente disperse, che offra vantaggi nel raggiungimento di un bioprinting ad alta fedeltà.
In questo protocollo, viene presentato un nuovo bagno di sospensione sacrificale granulato κ-carragenina con un livello uniforme inferiore al micron per la stampa 3D incorporata. Questo innovativo comportamento del bagno sub-microgel di rapida transizione inceppamento-sblocco facilita la fabbricazione precisa di scaffold biomimetici in idrogel con un’elevata fedeltà strutturale15. Utilizzando questo nuovo mezzo di sospensione, una serie di costrutti di tessuti e organi biomimetici caratterizzati da strutture tissutali multistrato vengono stampati con successo, impiegando un bioink composito composto da metacrilato di gelatina e metacrilato di fibro di seta. In questo studio, abbiamo scelto l’esofago come oggetto biomimetico per il bioprinting 3D principalmente perché l’esofago non solo ha una struttura tissutale multistrato, ma anche il suo strato muscolare mostra una struttura di stratificazione complessa circolare interna ed esterna longitudinale. Garantire il corretto allineamento e organizzazione di questi strati è essenziale per la rigenerazione funzionale dei tessuti. Pertanto, desideriamo fortemente replicare l’architettura multistrato dell’esofago. Ancora più importante, abbiamo utilizzato sub-microgel di κ-carragenina come bagno di sospensione e GelMA/SFMA come bioink per progettare e costruire un’impalcatura biomimetica per l’ingegneria tissutale. L’esofago stampato può essere facilmente rilasciato mediante ripetuti lavaggi salini tamponati con fosfato. Inoltre, il bagno sub-microgel di κ-carragenina è privo di sostanze citotossiche, garantendo un’elevata citocompatibilità15. Le cellule muscolari lisce caricate all’interno di scaffold anisotropi mostrano una notevole attività di diffusione. Questo mezzo di sospensione sub-microgel uniforme offre una nuova strada per la fabbricazione di tessuti e organi complessi attraverso la biostampa 3D incorporata.
La preparazione di bagni di sospensione sub-microgel di κ-carragenina per l’uso nel bioprinting è un processo attentamente orchestrato che prevede diversi passaggi critici per garantire che il mezzo risultante mostri le proprietà desiderate per supportare i bioink. Inizialmente, viene preparata una soluzione di κ-carragenina sciogliendo la polvere di κ-carragenina in acqua deionizzata a temperature elevate, creando una miscela omogenea. La…
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata supportata dalla Ningbo Natural Science Foundation (2022J121, 2023J159), dal progetto chiave della Natural Science Foundation della città di Ningbo (2021J256), dalla Open Foundation dello State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers (Fudan University) (K2024-35) e dal Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases della provincia di Zhejiang, Cina (2022E10026). Grazie per il supporto tecnico da parte delle strutture principali, Centro di scienze della salute dell’Università di Ningbo.
3D bioprinter | Custom-designed | ||
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole | Solarbio Life Science | C0065 | Ready-to-use |
405 nm UV light | EFL | XY-WJ01 | |
Cell Counter | Corning | Cyto smart 6749 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | STELLARIS 5 | |
DMEM high glucose | VivaCell | C3113-0500 | High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine |
Dynamic rotational rheometer | TA Instrument | Discovery HR-20 | |
Esophageal smooth muscle cells | Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University | Primary cells from the rabbit esophagus | |
Fetal bovine serum | UE | F9070L | |
Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin | Solarbio Life Science | CA1610 | 300T |
Gelatin methacrylate | EFL | EFL-GM-60 | 60% substitution |
k-carrageenan | Aladdin | C121013-100g | Reagent grade |
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate | Aladdin | L157759-1g | 365~405 nm |
Live-Dead kit | beyotime | C2015M | |
Microplate reader | Potenov | PT-3502B | |
Paraformaldehyde | Solarbio Life Science | P1110 | 4% |
Penicillin/streptomycin | Solarbio Life Science | MA0110 | 100 ´ |
Phosphate buffered saline | VivaCell | C3580-0500 | pH 7.2-7.4 |
Silk fibroin methacrylate | EFL | EFL-SilMA-001 | 39% substitution |
Triton X-100 | Solarbio Life Science | T8200 | |
Trypsin-EDTA | VivaCell | C100C1 | 0.25%, without phenol red |
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