В этом отчете представлена новая процедура подготовки образцов для визуализации нервно-мышечных соединений у личинок дрозофилы . Этот метод более эффективен в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом и особенно полезен для ультраструктурного анализа нервно-мышечного соединения дрозофилы .
Нервно-мышечное соединение дрозофилы (NMJ) стало ценной модельной системой в области нейробиологии. Применение конфокальной микроскопии в Drosophila NMJ позволяет исследователям получать синаптическую информацию, охватывающую как количественные данные о распространенности синапсов, так и подробное понимание их морфологии. Тем не менее, диффузное распределение и ограниченный визуальный диапазон ПЭМ создают проблемы для ультраструктурного анализа. В этом исследовании представлен инновационный и эффективный метод пробоподготовки, который превосходит традиционный подход. Процедура начинается с помещения металлической сетки в основание бутылки или пробирки с плоским дном, после чего на сетку помещаются неподвижные образцы личинок. Дополнительная сетка помещается поверх образцов, гарантируя, что они расположены между двумя сетками. Неподвижные образцы тщательно обезвоживаются и инфильтрируются перед началом процедуры закладки. Затем встраивание образцов в эпоксидную смолу выполняется методом плоского листа, что позволяет подготовить мышцы к позиционированию и рассечению. Благодаря этим шагам все мышцы личинок дрозофилы могут быть визуализированы с помощью световой микроскопии, что облегчает последующее позиционирование и разделение. Избыток смолы удаляется после локализации6-й и7-й мышц сегментов тела А2 и А3. Проводится серийное ультратонкое сечение6-й или7-й мышцы.
Электронная микроскопия является одним из самых идеальных методов изучения ультраструктуры биологических материалов, способных наглядно и точно продемонстрировать внутреннюю структуру клеток нананомасштабе1. Однако из-за сложности процесса пробоподготовки и высокой стоимости электронная микроскопия не так популярна, как световая микроскопия. Последние достижения в области методов электронной микроскопии привели к значительному улучшению качества изображения, что совпало со значительным снижением связанной с этим рабочей нагрузки. Следовательно, электронная микроскопия взяла на себя важную роль в развитии научных знаний в различных областях2.
Дрозофила является отличной животной моделью для выполнения генетических манипуляций с целью точного контроля пространственной и временной экспрессии генов-мишеней. Кроме того, дрозофила имеет преимущества короткого периода роста и легкого выращивания по сравнению с моделями млекопитающих; поэтому дрозофила широко используется в морфологических исследованиях 4,5.
У личинок дрозофилы бутоны нервно-мышечного перехода (NMJ) широко распространены в мышцах 6,7, и иммуноокрашивание NMJ может легко предоставить информацию о количестве и морфологии синапсов 8,9 . Бутоны NMJ, расположенные в6-й/7-й мышцах сегментовА2 иА3, хорошо подходят для количественных и морфологических исследований с помощью световой микроскопии. Это связано с их размерами и обилием 10,11. Таким образом, NMJ для личинок дрозофилы считаются полезной моделью для исследований в области нейробиологии12.
Тем не менее, наблюдать ультраструктуру бутонов NMJ с помощью ПЭМ сложно. Поскольку окно сканирования просвечивающей электронной микроскопии узкое, трудно расположить широко распространенные NMJ boutons13. Другая причина заключается в том, что стенка тела дрозофилы подвержена скручиванию во время стадии обезвоживания алкоголя по протоколу подготовки образца7.
В традиционных исследованиях обычно выбирали бутоны между6-й и7-й мышцами сегментовА2 иА3 в качестве образцового материала из-за их обилия и размера14,15. 6-я и7-я мышцы сегментовА2 иА3 больше других мышц и содержат больше бутонов. Однако при подготовке образцов для электронной микроскопии неподвижные образцы имели тенденцию становиться тонкими и склонными к скручиванию, что приводило к неправильному расположению6-й и7-й мышц сегментовА2 иА3.
Настоящим мы сообщаем о новой процедуре обработки, которая является более эффективной в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом подготовки образцов 7,16, позволяя образцам оставаться плоскими во время последующего обезвоживания, тем самым способствуя лучшему позиционированию нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы.
Образцы личинок дрозофилы имеют тенденцию сворачиваться во время обезвоживания, так как образцы тонкие, что затрудняет точное определение местоположения нервно-мышечного соединения, тем самым увеличивая сложность и рабочую нагрузку на подготовку образцов. Традиционное усоверш?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая Grant 32070811 и Фондом аналитических испытаний Юго-Восточного университета (Китай) 11240090971. Мы благодарим Лабораторию электронной микроскопии и Центр морфологического анализа Школы медицины Юго-Восточного университета, Нанкин, Китай.
1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |