このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの 神経筋接合部の超微細構造分析に特に有用です。
ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)は、神経科学の分野で貴重なモデルシステムとして浮上しています。ショウジョウバエNMJでの共焦点顕微鏡の適用により、研究者はシナプスの存在量に関する定量的データとそれらの形態に関する詳細な洞察の両方を網羅するシナプス情報を取得することができます。しかし、TEMの拡散分布と限られた視認範囲は、超微細構造解析に課題をもたらします。本研究では、従来のアプローチを凌駕する革新的で効率的なサンプル調製法を紹介します。この手順は、平底のボトルまたは試験管の底に金属メッシュを配置することから始まり、次に固定された幼虫サンプルをメッシュに配置します。追加のメッシュがサンプル上に配置され、サンプルが 2 つのメッシュの間に配置されます。固定されたサンプルは、包埋手順に進む前に、完全に脱水され、浸透されます。その後、サンプルをエポキシ樹脂に平らにシート状に埋め込むことで、筋肉の位置決めや切片作成のための準備が可能になります。これらのステップにより、ショウジョウバエの幼虫のすべての筋肉を光学顕微鏡で視覚化することができ、その後の位置決めと切片作成が容易になります。余分な樹脂は、体節A2とA3の6番目と7番目の筋肉を見つけた後に除去されます。6番目または7番目の筋肉の連続的な超薄切片化が行われます。
電子顕微鏡は、ナノスケールレベル1で細胞の内部構造を視覚的かつ正確に示すことができる、生体材料の超微細構造を研究するための最も理想的な方法の1つです。しかし、サンプル調製プロセスが複雑でコストが高いため、電子顕微鏡は光学顕微鏡ほど普及していません。近年の電子顕微鏡技術の進歩により、画質の大幅な向上がもたらされ、それと同時に関連する作業負荷も大幅に減少しています。そのため、電子顕微鏡は、さまざまな分野で科学知識を進歩させる上で重要な役割を担っています2。
ショウジョウバエは、標的遺伝子の空間的および時間的発現を正確に制御するための遺伝子操作を行うための優れた動物モデルです3。その上、ショウジョウバエには、哺乳類のモデルと比較して成長期間が短く、飼育が容易であるという利点があります。したがって、ショウジョウバエは形態学研究で広く使用されています4,5。
ショウジョウバエの幼虫では、神経筋接合部(NMJ)ブートンは筋肉に広く分布しており6,7、NMJの免疫染色は、シナプスの量と形態に関する情報を容易に提供できる8,9。A2およびA3セグメントの6番目/7番目の筋肉に位置するNMJボタンは、光学顕微鏡を使用した定量的および形態学的研究に適しています。これは、そのサイズと豊富さ10,11のためです。したがって、ショウジョウバエの幼虫のNMJは、神経科学研究の有用なモデルと考えられている12。
しかし、TEMでNMJブートンの超微細構造を観測することは困難です。透過型電子顕微鏡の走査窓が狭いため、広く分布しているNMJボタン13の位置決めが困難である。他の理由は、 ショウジョウバエ の体壁がサンプル調製プロトコル7のアルコール脱水ステップ中にカールしやすいことです。
従来の研究では、通常、A2 と A3 セグメントの 6番目と 7番目の筋肉の間のボタンが、その豊富さとサイズ14,15 のためにサンプル材料として選択されています。A2とA3セグメントの6番目と7番目の筋肉は、他の筋肉よりも大きく、より多くのブートンを含んでいます。しかし、電子顕微鏡用に試料を作製すると、固定された試料は薄くなり、カールしやすくなり、A2およびA3セグメントの6番目と7番目の筋肉の位置が不適切になっていました。
我々はここに、従来のサンプル調製方法と比較して、サンプルのカールを防ぐのにより効果的な新しい処理手順を報告する 7,16、その後の脱水中にサンプルを平らに保つことにより、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部のより良い位置決めを容易にする。
ショウジョウバエ の幼虫のサンプルは、サンプルが薄いため、脱水中に丸くなる傾向があり、神経筋接合部を正確に特定することが困難になり、サンプル調製の困難さと作業負荷が増加します。従来の改善は、サンプル7を短くすることですが、サンプルはまだ異なる程度にカールしていました。
私たちの方法では、2つの重要なステップがあり?…
The authors have nothing to disclose.
本研究は、中国自然科学基金会(Natural Science Foundation of China Grant 32070811)およびSoutheast University (China) Analysis Test Fund 11240090971の支援を受けて行われました。中国南京の東南大学医学部電子顕微鏡研究所および形態素解析センターに感謝します。
1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |