تحسين عملية تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ للتقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة
Summary
يقدم هذا التقرير إجراء جديدا لإعداد العينات لتصور الوصلات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة . هذه الطريقة أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية وهي مفيدة بشكل خاص لتحليل البنية التحتية للوصلات العصبية العضلية ذبابة الفاكهة .
Abstract
برز تقاطع ذبابة الفاكهة العصبي العضلي (NMJ) كنظام نموذجي قيم في مجال علم الأعصاب. يتيح تطبيق الفحص المجهري متحد البؤر في ذبابة الفاكهة NMJ للباحثين الحصول على معلومات متشابكة ، تشمل كلا من البيانات الكمية حول وفرة المشابك العصبية والرؤى التفصيلية في مورفولوجيتها. ومع ذلك ، فإن التوزيع المنتشر والنطاق البصري المحدود ل TEM يمثلان تحديات للتحليل البنيوي الفائق. تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة وفعالة لإعداد العينات تتجاوز النهج التقليدي. يبدأ الإجراء بوضع شبكة معدنية في قاعدة زجاجة مسطحة القاع أو أنبوب اختبار ، يليه وضع عينات اليرقات الثابتة على الشبكة. يتم وضع شبكة إضافية فوق العينات ، مما يضمن وضعها بين الشبكتين. يتم تجفيف العينات الثابتة تماما واختراقها قبل الشروع في إجراء التضمين. ثم يتم تضمين العينات في راتنجات الايبوكسي بطريقة ورقة مسطحة ، مما يسمح بإعداد العضلات لتحديد المواقع والتقسيم. بالاستفادة من هذه الخطوات ، يمكن تصور جميع عضلات يرقات ذبابة الفاكهة تحت المجهر الضوئي ، مما يسهل تحديد المواقع والتقسيم لاحقا. تتم إزالة الراتنج الزائد بعدتحديد موقع العضلات 6 و 7 من أجزاء الجسم A2 و A3. يتم إجراء التقسيم التسلسلي الرقيق للغايةللعضلة 6 أو 7.
Introduction
يعد المجهر الإلكتروني أحد أكثر الطرق مثالية لدراسة البنية التحتية للمواد البيولوجية التي يمكنها إظهار البنية الداخلية للخلايا بصريا وبدقة على المستوىالنانوي 1. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد عملية تحضير العينة والتكلفة العالية ، فإن المجهر الإلكتروني ليس شائعا مثل الفحص المجهري الضوئي. أدت التطورات الحديثة في تقنيات المجهر الإلكتروني إلى تحسينات كبيرة في جودة الصورة ، بالتزامن مع انخفاض ملحوظ في عبء العمل المرتبط بها. وبالتالي ، فقد لعب المجهر الإلكتروني دورا مهما في تطوير المعرفة العلمية في مجالات متنوعة2.
ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني ممتاز لأداء التلاعب الجيني للتحكم بدقة في التعبير المكاني والزماني للجينات المستهدفة3. إلى جانب ذلك ، تتمتع ذبابة الفاكهة بمزايا فترة نمو قصيرة وتربية سهلة مقارنة بنماذج الثدييات. لذلك ، يستخدم ذبابة الفاكهة على نطاق واسع في أبحاث التشكل4،5.
في يرقات ذبابة الفاكهة ، يتم توزيع عراوات الوصلة العصبية العضلية (NMJ) على نطاق واسع في العضلات 6,7 ، ويمكن أن يوفر التلوين المناعي ل NMJ بسهولة معلومات عن كمية المشبك العصبي والتشكل 8,9. إن عروات NMJ الموجودةفي العضلات 6 / 7 من المقاطعA 2 وA 3 مناسبة تماما للبحث الكمي والمورفولوجي باستخدام المجهر الضوئي. هذا بسبب حجمها ووفرتها10,11. لذلك ، تعتبر يرقات ذبابة الفاكهة NMJs نموذجا مفيدا لأبحاث علم الأعصاب12.
ومع ذلك ، من الصعب مراقبة البنية التحتية ل NMJ bouton بواسطة TEM. نظرا لأن نافذة المسح للمجهر الإلكتروني النافذ ضيقة ، فمن الصعب وضع عروات NMJ الموزعة على نطاق واسع13. السبب الآخر هو أن جدار جسم ذبابة الفاكهة عرضة للتجعيد أثناء خطوة تجفيف الكحول في بروتوكول تحضيرالعينة 7.
عادة ما تختار الدراسات التقليدية عرواتبين العضلات 6 و 7 من الجزأينA 2 وA 3 كمواد عينة بسبب وفرتها وحجمها14,15. العضلات 6 و 7 من الأجزاءA 2 و A3 أكبر من العضلات الأخرى وتحتوي على المزيد من العروات. ومع ذلك ، عندما تم تحضير العينات للمجهر الإلكتروني ، تميل العينات الثابتة إلى أن تصبح رقيقة وعرضة للتجعيد ، مما يؤدي إلى وضع غير صحيحللعضلات 6 و 7 من الجزأين A2 وA 3.
نبلغ بموجب هذا عن إجراء معالجة جديد أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية لإعدادالعينات 7,16 ، من خلال السماح للعينات بالبقاء مسطحة أثناء الجفاف اللاحق ، وبالتالي تسهيل وضع أفضل للتقاطعات العصبية العضلية ليرقات ذبابة الفاكهة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تميل عينات يرقات ذبابة الفاكهة إلى الالتفاف أثناء الجفاف ، حيث تكون العينات رقيقة ، مما يجعل من الصعب تحديد موقع الوصلة العصبية العضلية بدقة ، مما يزيد من صعوبة وعبء العمل لإعداد العينة. التحسين التقليدي هو تقصير العينة7 ، لكن العينات كانت لا تزال مجعدة بدرجات مختلفة.
<p…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين جرانت 32070811 ، وصندوق اختبار التحليل بجامعة جنوب شرق (الصين) 11240090971. نشكر مختبر المجهر الإلكتروني ومركز التحليل المورفولوجي ، كلية الطب ، جامعة الجنوب الشرقي ، نانجينغ ، الصين.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
Referências
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
- Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).
- Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
- Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).
- Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
- Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
- Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
- Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).
- Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
- Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
- Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
- Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
- Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
- Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).
