Individuazione di intermedi di ricombinazione omologhi tramite legatura di prossimità e PCR quantitativa in Saccharomyces cerevisiae

La ricombinazione omologa (HR) è un meccanismo ad alta fedeltà di riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA (DSB), dei legami incrociati tra filamenti e delle lacune del ssDNA, nonché un percorso per la tolleranza al danno del DNA. L’HR differisce dai percorsi soggetti a errori per la riparazione/tolleranza al danno al DNA, come la giunzione finale non omologa (NHEJ) e la sintesi translesionale, in quanto utilizza un DNA duplex intatto e omologo come donatore per modellare l’evento di riparazione. Inoltre, molti degli intermedi chiave nel percorso HR sono reversibili, consentendo una regolazione squisita delle singole fasi del percorso. Durante le fasi S, G2 e M del ciclo cellulare, HR compete con NHEJ per la riparazione dei DSB a due estremità¹. Inoltre, la HR è essenziale per la replicazione del DNA per la riparazione dei danni al DNA associati alla replicazione, comprese le lacune del ssDNA e le DSB unilaterali, e come meccanismo di bypass della lesione del DNA².

Un intermedio critico nel percorso HR è il ciclo di spostamento, o D-loop (Figura 1). Dopo la resezione finale, la ricombinasi centrale nella reazione, Rad51, si carica sul ssDNA appena resecato della molecola rotta, formando un filamento elicoidale². Rad51 effettua quindi una ricerca di omologia per identificare un donatore omologo adatto, tipicamente il cromatide fratello nelle cellule somatiche. Il D-loop si forma quando il filamento Rad51-ssDNA invade un DNA duplex omologo, che porta all’accoppiamento di basi Watson-Crick del filamento rotto con il filamento complementare del donatore, spostando il filamento donatore opposto. L’estensione dell’estremità 3′ del filamento rotto da parte di una DNA polimerasi sostituisce le basi che sono state perse durante l’evento di danno al DNA e promuove la risoluzione dell’intermedio esteso D-loop in un prodotto dsDNA attraverso la ricottura del filamento dipendente dalla sintesi (SDSA), la giunzione a doppio Holliday (dHJ) o le sottovie HR di replicazione indotta da rottura (BIR).

I saggi che monitorano fisicamente gli intermedi nel percorso HR consentono l’analisi dei requisiti genetici per ogni fase (ad esempio, analisi del percorso). La formazione di DSB, la resezione finale, i dHJ, le bolle di replicazione BIR e i prodotti HR sono facilmente osservabili dal Southern blotting 3,4,5,6,7. Tuttavia, il Southern blotting non riesce a riferire sui D-loop nascenti ed estesi e, quindi, è necessario un metodo alternativo per misurare in modo affidabile queste molecole articolari ^4,8,9. Una strategia ampiamente utilizzata per analizzare la nascente formazione del D-loop è l’immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) di Rad51 accoppiata con PCR quantitativa (qPCR)^10,11. Tuttavia, l’associazione di Rad51 con il dsDNA misurata da ChIP-qPCR è indipendente dall’omologia di sequenza e dal fattore accessorio Rad51 Rad54^10,11. Al contrario, un segnale apprezzabile che utilizza il metodo di analisi D-loop qui presentato, chiamato saggio di acquisizione D-loop (DLC), dipende dalla formazione di DSB, dall’omologia di sequenza, da Rad51 e dalle proteine accessorie Rad51 Rad52 e Rad54⁸. La scoperta che la formazione di D-loop promossa da Rad51 da Saccharomyces cerevisiae dipende da Rad54 in vivo è in accordo con numerosi esperimenti di ricostituzione in vitro che indicano che Rad54 è necessario per la ricerca di omologia e la formazione di D-loop da parte del lievito de erba Rad51 8,12,13,14,15.

Gli attuali approcci per misurare l’estensione del D-loop, principalmente attraverso la PCR semi-quantitativa, sono altrettanto problematici. Un tipico test basato sulla PCR per rilevare l’estensione del D-loop amplifica una sequenza unica, risultante dalla ricombinazione tra un sito di rottura e un donatore ectopico e dalla successiva sintesi del DNA associata alla ricombinazione, tramite un primer a monte della regione di omologia sul filamento rotto e un altro primer a valle della regione di omologia sul filamento donatore. Utilizzando questo metodo, la rilevazione della sintesi del DNA associata alla ricombinazione richiede il fattore di processività Pol32¹⁶ non essenziale δ Pol32. Questa scoperta è in conflitto con l’osservazione che la delezione di POL32 ha solo un lieve effetto sulla conversione genica in vivo¹⁷. Inoltre, questi test basati sulla PCR non riescono a risolvere temporalmente l’estensione del D-loop e la formazione del prodotto BIR, suggerendo che il segnale deriva da prodotti dsDNA piuttosto che da intermedi ssDNA^17,18,19. Il test di estensione D-loop (DLE) è stato recentemente sviluppato per risolvere queste discrepanze. Il test DLE quantifica la sintesi del DNA associata alla ricombinazione in un sito ~ 400 coppie di basi (bp) a valle dell’iniziale 3′ invasione fine⁹. Con questo metodo, l’estensione del D-loop è indipendente da Pol32 ed è rilevabile entro 4 ore dall’induzione post-DSB, mentre i prodotti BIR vengono osservati per la prima volta a 6 ore. Infatti, una recente pubblicazione dei laboratori Haber e Malkova ha osservato che l’uso di questo metodo di preparazione del DNA genomico porta singolarmente alla conservazione del ssDNA ^9,20.

Qui, i test DLC e DLE sono descritti in dettaglio. Questi saggi si basano sulla legatura di prossimità per rilevare le anse D nascenti ed estese in S. cerevisiae (Figura 2)^8,9. I prodotti BIR possono essere quantificati utilizzando lo stesso sistema di analisi. Per entrambi i test, la formazione di DSB in un sito di taglio dell’endonucleasi HO situato nel locus URA3 sul cromosoma (Chr.) V è indotta dall’espressione dell’endonucleasi HO sotto il controllo di un promotore inducibile dal galattosio. L’invasione del filamento di DNA mediata da Rad51 porta alla nascente formazione di D-loop nel sito di un donatore ectopico situato nel locus LYS2 su Chr. II. Poiché il lato destro del DSB manca di omologia con il donatore, la riparazione tramite SDSA e formazione di dHJ non è fattibile. La riparazione iniziale del DSB da parte di BIR è possibile, ma la formazione di prodotti vitali è inibita dalla presenza del centromero²¹. Questo disegno deliberato impedisce la riparazione produttiva del DSB, evitando così la ripresa della crescita da parte delle cellule con DBS riparati, che altrimenti potrebbero superare la coltura durante l’analisi del decorso temporale.

Nel test DLC, la reticolazione psoralenica dei due filamenti del DNA eteroduplex all’interno del D-loop preserva l’intermedio di ricombinazione. Dopo il ripristino del sito enzimatico di restrizione sul filamento rotto (resecato) e la digestione, la reticolazione consente la legatura delle sequenze uniche a monte del DNA omologo rotto e donatore. Utilizzando la qPCR, viene quantificato il livello di molecola di DNA chimerico presente in ciascun campione. Nel test DLE, la reticolazione non è richiesta e il ripristino del sito enzimatico di restrizione e la digestione seguiti dalla legatura intramolecolare collegano invece l’estremità 5′ della molecola rotta all’estremità 3′ appena estesa. Ancora una volta, la qPCR viene utilizzata per quantificare le quantità relative di questo prodotto chimerico in ciascun campione. In assenza di ripristino del sito enzimatico di restrizione, il test DLE riporta i livelli relativi del prodotto BIR (dsDNA) che si forma dopo l’estensione del D-loop.

Vengono mostrati i risultati rappresentativi per ciascun test che utilizza un ceppo wild type, e i lettori sono rimandati a Piazza et al.8 e Piazza et al.9 per l’uso di questi saggi per l’analisi dei mutanti di ricombinazione ^8,9. L’intento di questo contributo è quello di consentire ad altri laboratori di adottare i saggi DLC e DLE, e il supporto per loro è disponibile su richiesta.