Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

Homologe Rekombination (HR) ist ein High-Fidelity-Mechanismus zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Interstrang-Vernetzungen und ssDNA-Lücken sowie ein Weg für die DNA-Schadenstoleranz. HR unterscheidet sich von fehleranfälligen Wegen für die Reparatur / Toleranz von DNA-Schäden, wie nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und Transläsionssynthese, dadurch, dass es eine intakte, homologe Duplex-DNA als Spender verwendet, um das Reparaturereignis zu modellieren. Darüber hinaus sind viele der wichtigsten Zwischenprodukte im HR-Pfad reversibel, was eine exquisite Regulierung der einzelnen Pfadschritte ermöglicht. Während der S-, G2- und M-Phasen des Zellzyklus konkurriert HR mit NHEJ um die Reparatur der zweiseitigen DSBs¹. Darüber hinaus ist HR essentiell für die DNA-Replikation für die Reparatur von replikationsassoziierten DNA-Schäden, einschließlich ssDNA-Lücken und einseitigen DSBs, und als Mechanismus des DNA-Läsionsbypasses².

Ein kritisches Zwischenprodukt im HR-Pfad ist die Verdrängungsschleife oder D-Schleife (Abbildung 1). Nach der Endresektion lädt die zentrale Rekombinase in der Reaktion, Rad51, auf die neu resezierte ssDNA des gebrochenen Moleküls und bildet ein helikales Filament². Rad51 führt dann eine Homologiesuche durch, um einen geeigneten homologen Spender zu identifizieren, typischerweise die Schwesterchromatide in somatischen Zellen. Die D-Schleife wird gebildet, wenn das Rad51-ssDNA-Filament in eine homologe Duplex-DNA eindringt, was zur Watson-Crick-Basenpaarung des gebrochenen Strangs mit dem komplementären Strang des Donors führt und den gegenüberliegenden Donorstrang verdrängt. Die Verlängerung des 3′-Endes des gebrochenen Strangs durch eine DNA-Polymerase ersetzt die Basen, die während des DNA-Schadensereignisses verloren gegangen sind, und fördert die Auflösung des verlängerten D-Loop-Zwischenprodukts in ein dsDNA-Produkt durch das syntheseabhängige Strangglühen (SDSA), das Doppel-Holliday-Diaphragma (dHJ) oder die Break-induzierten Replikationswege (BIR).

Assays, die die Zwischenprodukte im HR-Signalweg physisch überwachen, ermöglichen die Analyse der genetischen Anforderungen für jeden Schritt (d.h. Signalweganalyse). DSB-Bildung, Endresektion, dHJs, BIR-Replikationsblasen und HR-Produkte werden leicht durch Southern Blotting 3,4,5,6,7 beobachtet. Southern Blotting berichtet jedoch nicht über entstehende und ausgedehnte D-Schleifen, und daher ist eine alternative Methode zur zuverlässigen Messung dieser Gelenkmoleküle erforderlich ^4,8,9. Eine weit verbreitete Strategie zur Analyse der entstehenden D-Loop-Bildung ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) von Rad51 in Verbindung mit quantitativer PCR (qPCR)^10,11. Die Rad51-Assoziation mit dsDNA, gemessen mittels ChIP-qPCR, ist jedoch unabhängig von der Sequenzhomologie und dem Rad51-Akzessorfaktor Rad54^10,11. Im Gegensatz dazu hängt ein nennenswertes Signal mit der hier vorgestellten Methode der D-Loop-Analyse, dem sogenannten D-Loop Capture (DLC)-Assay, von der DSB-Bildung, der Sequenzhomologie, Rad51 und den Rad51-Akzessorproteinen Rad52 und Rad54⁸ ab. Die Feststellung, dass die von Saccharomyces cerevisiae Rad51 geförderte D-Loop-Bildung von Rad54 in vivo abhängt, stimmt mit zahlreichen In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten überein, die darauf hindeuten, dass Rad54 für die Homologiesuche und D-Loop-Bildung durch knospende Hefe Rad51 8,12,13,14,15 benötigt wird.

Ähnlich problematisch sind aktuelle Ansätze zur Messung der D-Loop-Extension, vor allem mittels semi-quantitativer PCR. Ein typischer PCR-basierter Assay zum Nachweis der D-Loop-Extension amplifiziert eine einzigartige Sequenz, die sich aus der Rekombination zwischen einer Bruchstelle und einem ektopischen Donor und der anschließenden rekombinationsassoziierten DNA-Synthese ergibt, über einen Primer stromaufwärts der Region der Homologie auf dem gebrochenen Strang und einen weiteren Primer stromabwärts der Region der Homologie auf dem Donorstrang. Mit dieser Methode erfordert der Nachweis der rekombinationsassoziierten DNA-Synthese den nicht-essentiellen Pol-δ-Prozessivitätsfaktor Pol32¹⁶. Dieser Befund steht im Widerspruch zu der Beobachtung, dass die POL32-Deletion nur einen geringen Einfluss auf die Genkonversion in vivo^{hat 17}. Darüber hinaus können diese PCR-basierten Assays die D-Loop-Erweiterung und die BIR-Produktbildung nicht zeitlich auflösen, was darauf hindeutet, dass das Signal von dsDNA-Produkten und nicht von ssDNA-Zwischenprodukten 17,18,19 stammt. Der D-loop Extension (DLE) Assay wurde kürzlich entwickelt, um diese Diskrepanzen zu beheben. Der DLE-Assay quantifiziert die rekombinationsassoziierte DNA-Synthese an einer Stelle ~400 Basenpaare (bp) stromabwärts des anfänglichen 3′-eindringenden Endes⁹. Bei dieser Methode ist die D-Schleifenverlängerung unabhängig von Pol32 und innerhalb von 4 h nach der DSB-Induktion nachweisbar, während BIR-Produkte zuerst nach 6 h beobachtet werden. In einer kürzlich veröffentlichten Veröffentlichung der Laboratorien Haber und Malkova wurde festgestellt, dass die Verwendung dieser Methode zur Herstellung genomischer DNA ausschließlich zur Erhaltung der ssDNA führt ^9,20.

Hier werden die DLC- und DLE-Assays ausführlich beschrieben. Diese Assays beruhen auf der Proximity-Ligatur, um entstehende und ausgedehnte D-Schleifen in S. cerevisiae zu erkennen (Abbildung 2)^8,9. BIR-Produkte können mit demselben Assay-System quantifiziert werden. Für beide Assays wird die DSB-Bildung an einer HO-Endonuklease-Schnittstelle am URA3-Locus auf Chromosom (Chr.) V durch die Expression der HO-Endonuklease unter der Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promotors induziert. Rad51-vermittelte DNA-Stranginvasion führt zur entstehenden D-Schleifenbildung an der Stelle eines ektopischen Spenders, der sich am LYS2-Locus auf Chr. II befindet. Da die rechte Seite des DSB keine Homologie zum Spender aufweist, ist eine Reparatur über SDSA und dHJ-Bildung nicht möglich. Eine anfängliche Reparatur des DSB durch BIR ist möglich, aber die Bildung lebensfähiger Produkte wird durch das Vorhandensein des^{Zentromers 21} gehemmt. Dieses bewusste Design verhindert eine produktive DSB-Reparatur und vermeidet so die Wiederaufnahme des Wachstums durch Zellen mit reparierten THSs, die sonst die Kultur während der Zeitverlaufsanalyse überholen könnten.

Im DLC-Assay bewahrt die psorale Vernetzung der beiden Stränge der Heteroduplex-DNA innerhalb der D-Schleife das Rekombinationszwischenprodukt. Nach der Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle am gebrochenen (resezierten) Strang und der Verdauung ermöglicht die Vernetzung die Ligation der einzigartigen Sequenzen stromaufwärts der homologen gebrochenen und Spender-DNAs. Mit Hilfe der qPCR wird der Gehalt an chimären DNA-Molekülen in jeder Probe quantifiziert. Im DLE-Assay ist keine Vernetzung erforderlich, und die Wiederherstellung und Verdauung der Restriktionsenzymstelle, gefolgt von einer intramolekularen Ligation, verbindet stattdessen das 5′-Ende des gebrochenen Moleküls mit dem neu verlängerten 3′-Ende. Auch hier wird qPCR verwendet, um die relativen Mengen dieses chimären Produkts in jeder Probe zu quantifizieren. In Abwesenheit einer Restriktionsenzymstellenwiederherstellung berichtet der DLE-Assay über die relativen Konzentrationen des BIR-Produkts (dsDNA), das nach der D-Schleifenverlängerung gebildet wird.

Repräsentative Ergebnisse für jeden Assay unter Verwendung eines Wildtypstamms werden gezeigt, und die Leser werden auf Piazza et al.8 und Piazza et al.9 verwiesen, um diese Assays für die Analyse von Rekombinationsmutanten ^8,9 zu verwenden. Die Absicht dieses Beitrags ist es, anderen Laboratorien die Übernahme der DLC- und DLE-Assays zu ermöglichen, und Unterstützung für sie ist auf Anfrage erhältlich.