Détection d’intermédiaires de recombinaison homologues par ligature de proximité et PCR quantitative chez Saccharomyces cerevisiae

La recombinaison homologue (HR) est un mécanisme haute fidélité de réparation des cassures double brin de l’ADN (DSB), des liaisons croisées inter-brins et des lacunes de l’ADNs, ainsi qu’une voie de tolérance aux dommages de l’ADN. HR diffère des voies sujettes aux erreurs pour la réparation / tolérance aux dommages de l’ADN, telles que la jonction terminale non homologue (NHEJ) et la synthèse de translésion, en ce sens qu’elle utilise un ADN duplex homologue intact comme donneur pour modéliser l’événement de réparation. De plus, bon nombre des intermédiaires clés de la voie RH sont réversibles, ce qui permet une régulation exquise des étapes individuelles de la voie. Pendant les phases S, G2 et M du cycle cellulaire, HR est en concurrence avec NHEJ pour la réparation des DSB¹ à deux extrémités. En outre, la HR est essentielle à la réplication de l’ADN pour la réparation des dommages à l’ADN associés à la réplication, y compris les lacunes de l’ADNss et les DSB unilatérales, et en tant que mécanisme de pontage des lésions de l’ADN².

Un intermédiaire critique dans la voie HR est la boucle de déplacement, ou boucle D (Figure 1). Après la résection finale, la recombinase centrale dans la réaction, Rad51, se charge sur l’ADNss nouvellement réséqué de la molécule brisée, formant un filament hélicoïdal². Rad51 effectue ensuite une recherche d’homologie pour identifier un donneur homologue approprié, généralement la chromatide sœur dans les cellules somatiques. La boucle D est formée lorsque le filament Rad51-ssDNA envahit un ADN duplex homologue, ce qui conduit à l’appariement de la base Watson-Crick du brin brisé avec le brin complémentaire du donneur, déplaçant le brin donneur opposé. L’extension de l’extrémité 3′ du brin brisé par une ADN polymérase remplace les bases qui ont été perdues lors de l’événement de dommages à l’ADN et favorise la résolution de l’intermédiaire de la boucle D étendue en un produit d’ADNds par le recuit du brin dépendant de la synthèse (SDSA), la jonction double Holliday (dHJ) ou les sous-voies HR de réplication induite par rupture (BIR).

Les tests qui surveillent physiquement les intermédiaires dans la voie HR permettent d’analyser les besoins génétiques pour chaque étape (c.-à-d. l’analyse de la voie). La formation de DSB, la résection terminale, les dHJ, les bulles de réplication BIR et les produits HR sont facilement observés par transfert de Southern 3,4,5,6,7. Pourtant, le transfert de Southern ne rend pas compte des boucles D naissantes et étendues et, par conséquent, une méthode alternative pour mesurer de manière fiable ces molécules articulaires est nécessaire ^4,8,9. Une stratégie largement utilisée pour analyser la formation naissante de boucles D est l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de Rad51 couplée à la PCR quantitative (qPCR)^10,11. Cependant, l’association Rad51 avec l’ADNds telle que mesurée par ChIP-qPCR est indépendante de l’homologie de séquence et du facteur accessoire Rad51 Rad54^10,11. En revanche, un signal appréciable utilisant la méthode d’analyse de boucle D présentée ici, appelée test de capture de boucle D (DLC), dépend de la formation de DSB, de l’homologie de séquence, de Rad51 et des protéines accessoires Rad51 Rad52 et Rad54⁸. La découverte que la formation de la boucle D favorisée par Saccharomyces cerevisiae Rad51 dépend de Rad54 in vivo est en accord avec de nombreuses expériences de reconstitution in vitro indiquant que Rad54 est nécessaire pour la recherche d’homologie et la formation de boucles D par la levure bourgeonnante Rad51 8,12,13,14,15.

Les approches actuelles de mesure de l’extension de la boucle D, principalement par PCR semi-quantitative, sont tout aussi problématiques. Un test typique basé sur la PCR pour détecter l’extension de la boucle D amplifie une séquence unique, résultant de la recombinaison entre un site de rupture et un donneur ectopique et de la synthèse ultérieure de l’ADN associée à la recombinaison, via une amorce en amont de la région d’homologie sur le brin brisé et une autre amorce en aval de la région d’homologie sur le brin donneur. En utilisant cette méthode, la détection de la synthèse d’ADN associée à la recombinaison nécessite le facteur de processivité non essentiel Pol δ Pol32¹⁶. Cette découverte est en contradiction avec l’observation selon laquelle la délétion de POL32 n’a qu’un effet léger sur la conversion génique in vivo¹⁷. De plus, ces tests basés sur la PCR ne parviennent pas à résoudre temporellement l’extension de la boucle D et la formation de produits BIR, ce qui suggère que le signal résulte de produits ADNds plutôt que d’intermédiaires de l’ADNss^17,18,19. Le test d’extension de la boucle D (DLE) a récemment été développé pour corriger ces divergences. Le test DLE quantifie la synthèse d’ADN associée à la recombinaison sur un site ~400 paires de bases (pb) en aval de l’extrémité^{initiale envahissante 3′ 9}. Par cette méthode, l’extension de la boucle D est indépendante de Pol32 et est détectable dans les 4 h suivant l’induction DSB, tandis que les produits BIR sont observés pour la première fois à 6 h. En effet, une publication récente des laboratoires Haber et Malkova a noté que l’utilisation de cette méthode de préparation de l’ADN génomique aboutit singulièrement à la préservation de l’ADNss ^9,20.

Ici, les tests DLC et DLE sont décrits en détail. Ces tests reposent sur la ligature de proximité pour détecter les boucles D naissantes et étendues chez S. cerevisiae (Figure 2)^8,9. Les produits BIR peuvent être quantifiés à l’aide de ce même système de dosage. Pour les deux essais, la formation de DSB à un site de coupe de l’endonucléase HO situé au locus URA3 sur le chromosome (Chr.) V est induite par l’expression de l’endonucléase HO sous le contrôle d’un promoteur inductible par le galactose. L’invasion de brins d’ADN médiée par Rad51 conduit à la formation naissante d’une boucle D sur le site d’un donneur ectopique situé au locus LYS2 sur Chr. II. Comme le côté droit du DSB n’a pas d’homologie avec le donneur, la réparation via SDSA et la formation de dHJ n’est pas réalisable. La réparation initiale du DSB par BIR est possible, mais la formation de produits viables est inhibée par la présence du centromère²¹. Cette conception délibérée empêche la réparation productive du DSB, évitant ainsi la reprise de la croissance par les cellules avec des DBS réparés, qui pourraient autrement dépasser la culture pendant l’analyse du cours du temps.

Dans le test DLC, la réticulation psoralène des deux brins de l’ADN hétéroduplex dans la boucle D préserve l’intermédiaire de recombinaison. Après la restauration du site enzymatique de restriction sur le brin brisé (réséqué) et la digestion, la réticulation permet la ligature des séquences uniques en amont de l’ADN homologue brisé et donneur. À l’aide de la qPCR, le niveau de molécule d’ADN chimérique présente dans chaque échantillon est quantifié. Dans le test DLE, la réticulation n’est pas nécessaire, et la restauration du site enzymatique de restriction et la digestion suivies d’une ligature intramoléculaire relient plutôt l’extrémité 5′ de la molécule cassée à l’extrémité 3′ nouvellement étendue. Encore une fois, la qPCR est utilisée pour quantifier les quantités relatives de ce produit chimérique dans chaque échantillon. En l’absence de restauration du site enzymatique de restriction, le test DLE rend compte des niveaux relatifs du produit BIR (ADNds) qui se forme après l’extension de la boucle D.

Des résultats représentatifs pour chaque essai utilisant une souche de type sauvage sont présentés, et les lecteurs sont invités à se reporter à Piazza et al.8 et Piazza et al.9 pour l’utilisation de ces essais pour l’analyse des mutants de recombinaison ^8,9. L’objectif de cette contribution est de permettre à d’autres laboratoires d’adopter les tests DLC et DLE, et un soutien est disponible sur demande.